关键词： 葡糖激酶糖尿病1，5-脱水葡萄糖醇

【摘要】目的建立一种测定血中1，5-脱水葡萄糖醇(1，5-AG)的方法，辅助诊断糖尿病。方法采用葡萄糖激酶去除血清样品内源葡萄糖干扰，以吡喃糖氧化酶 (PROD)氧化血清1，5-AG，生成1，5-脱水果糖和H₂O₂，后者用Trinder反应进行比色测定。结果该方法PROD用量为80 kU/L，反应(终点)时间10分钟，最低检测限为1.98 μmol/L，1，5-AG在633.3 μmol/L以内线性良好。高(378.66 μmol/L)、中(216.46 μmol/L)、低(19.42 μmol/L)浓度批内变异系数（CV）分别为0.62%、1.41%和1.6%，批间CV为1.04%、1.83%和3.51%，平均回收率为99.8%。测定了48例糖尿病患者血清1，5-AG含量(±s)为(30.7±16.4) μmol/L，显著低于健康对照组［(170.6±48.2) μmol/L］，P＜0.001。结论该法简便快速、灵敏、准确和稳定、特异，可用于糖尿病的及时诊断与监控，适合于各类实验室常规应用。

Fully enzymatic method for measuring 1, 5-anhydro-D-glucitol in serum

CHEN Guojun, DONG Jinmu, LU Jianhong, et al.

Zhejiang Provincial Corps Hospital, Chinese People′s Armed Police Forces, Jiaxing 314000

【Abstract】ObjectiveTo establish a new method for measuring 1, 5 anhydroD-glucitol (1,5-AG) in serum as an aid in diagnosing diabetes mellitus. MethodsGlucokinase was used to get rid of interference of internal glucose in serum sample, and pyranose oxidase (PROD) was used to oxiclize 1, 5-AG with the formation of 1, 5-anhydrofructose and H₂O₂. Measurement was done according to the Trinder reaction principle. ResultsThe concentration of PROD used in this method was 80 kU/L, with the reaction time being 10 minutes, the detection limit 1.98 μmol/L, and the linear range within 633.3 μmol/L. With high, medial, and low concentrations, the rate of intraassay CVs was 0.62%, 1.41%, and 1.6% respectively, and the rate of a interassay CVs of 1.04%, 1.83%, and 3.51%. The average recovery was 99.8%. 1, 5-AG was measured in 48 patients with diabetes mellitus (±s=(30.7±16.4) μmol/L), which was much lower than that of the control group (±s=(170.6±48.2) μmol/L) (P＜0.001). ConclusionsThis method is easy, rapid, and precise to diagnose and monitor diabetes mellitus.

【Key words】GlucokinaseDiabetes mellitus1,5-Anhydroglucitol

1，5-脱水葡萄糖醇(1,5-AG)，又称1，5-脱水山梨醇，是吡喃葡萄糖的C₁-脱氧形式。其含量在多元醇糖类物质中仅次于葡萄糖。1973年Pitkanen等报道它存在于人脑脊液和血清中，并于患糖尿病时显著降低。研究表明，血清1，5-AG检测作为筛选糖尿病的随机实验比其他评价实验更为灵敏^［1，2］。1，5-AG测定的方法虽多，但均需昂贵的专用仪器，操作繁琐，不适于临床常规检验。我们参照Fukumura等^［3］报道略加改进，建立了简便快速，既能自动分析又可手工操作，适合临床实验室常规开展的血清1，5-AG全酶测定方法，并报道其初步临床应用结果。

材料与方法

一、试剂

1.去除血清样品内源葡萄糖干扰的试剂（R_I)：浓度为50 mmo1/L的2-玛啡琳乙基磺酸（MES）溶液（pH 5.9)内含葡萄糖激酶（GK，Sigma公司产品）4.0 kU，丙酮酸激酶(PK)3.0 kU，抗坏血酸氧化酶(AO)5.0 kU，三磷酸腺苷(ATP) 1.0 mmol(德国BM公司产品)，磷酸丙酮酸烯醇式盐(PEP)4.0 mmol，4-氨基安替吡啉(4-AAP)1.5 mmol，MgCl₂ 7.5 mmol，KCl 50.0 mmol。

2.检测1，5-AG的试剂（R_Ⅱ）：浓度为200 mmol/L的N-2-羟乙基哌嗪N′-2-乙烷磺酸（HEPES）溶液（pH 7.6）内含吡喃糖氧化酶(PROD，日本Takara公司产品)80 kU ，辣根过氧化物酶(HRP)10 kU，3-羟基-2、4、6-三碘苯甲酸（HTIB，美国Polyscience公司）4.5 mmol。

图1显色反应式

3.1，5-AG标准液：称取1，5-脱水山梨醇（1，5-Anhydro-D-Sorbtol，Pw 164.2，Sigma公司产品）10.0 mg置于200 ml容量瓶中，加蒸馏水50 ml，溶解后加蒸馏水至刻度，即成304.5 μmol/L标准液。

二、仪器

日立7060型全自动生化分析仪；UV-754型分光光度计（上海第三分析仪器厂）。

三、血清标本

糖尿病患者48例（1型10例，2型38例），均符合1985年WHO糖尿病分类及诊断标准。男29例，女19例，年龄17～78岁，平均(53.2±17.9)岁。病程2个月～25年。空腹血糖（FBG）在2.99～40.30 mmol/L之间。健康人120名，FBG、果糖胺（FA）及肝、肾功能试验均正常，无既往糖尿病史。年龄9～68岁，平均(39.9±17.1)岁，男64例，女56例。年龄：9～29岁45例，～49岁38例，～68岁37例。

四、方法

1.方法原理：首先用R_I处理血清，经由GK和PK偶联系统使血清中葡萄糖彻底转化为不与PROD反应的6-磷酸葡萄糖，以除去葡萄糖的干扰作用。然后加R_Ⅱ，其中的被测1，5-AG氧化成1，5-脱水果糖和H₂O₂，后者经HRP、4-AAP和HTIB反应系统作用Trinder反应，发生显色反应进行比色测定。反应式如图1。

2.参数设置：两点终点法，温度37℃，主波长546 nm，副波长700 nm，样品量8 μl，R_I220 μl，反应5分钟，再加R_Ⅱ110 μl，反应5分钟，监测16和32点吸光度（A）。定标液O（蒸馏水）和304.5 μmol/L 1，5-AG。

3.手工测试：除上述基本参数外，样品和试剂量按比例增减。空白管调零，波长546 nm。读取各管A。计算1，5-AG（μmol/L)=(测定管A/标准管A）×304.5。

4.干扰试验对照方法：（1）血糖（BG）测定，葡萄糖氧化酶法，≥6.66 mmol/L为阳性。（2）糖化血红蛋白（GHbA1c)测定，微柱亲和层析法，≤7.24%(n=120，+1.96s)为正常参考值。（3）FA测定，化学比色法，≤2.3 mmol/L(n=120，+1.96 s)为正常参考值。

结果

1.PROD浓度的选择：配制50～100 kU/L梯度的PROD溶液组成应用试剂（R_Ⅱ），其他条件不变，各测定1份高浓度的1，5-AG标准液（633.3 μmol/L)。图2结果表明，PROD在80 kU/L时反应已恒定。

2.反应动力曲线：对蒸馏水、标准液及样品的测定结果表明：蒸馏水空白加R_Ⅰ和R_Ⅱ后A无甚变化，靠近横轴呈一条基本平坦的曲线。标准液和样品反应过程相同，加入R_Ⅱ后显色急剧增加，监测至25点时显色达顶点。见图3。

3.线性与最低检测限：取1份健康人混合血清，用G₁₀胶联葡聚糖凝胶透析后(反复测得1，5-AG为1.4 μmol/L)一分为二，1份内加入1，5-AG标准物，混匀后反复测定1，5-AG为633.3 μmol/L。再用另一份混合血清作基样将其稀释成不同浓度（39、77、254、443、633 μmol/L)，用本法连续作1，5-AG定标4次，仪器自动拟合标准曲线，结果显示在633.3 μmol/L以内线性甚好。回归方程（X为浓度，Y为平均吸光度）为Y=(4.72×10^-4)X+0.0155 5，r=0.999 6。对标准曲线的零浓度标准（蒸馏水）重复测定14次，求出，再加上3s，对应于标准曲线的1，5-AG浓度为最低检测限，即1.98 μmol/L。与文献［3］报道接近。

图2吡喃糖氧化酶用量选择

图31，5-AG反应进程曲线

4.精密度：取低、中和高值混合血清各1份，做批内和批间（每天各1份连续测定10天）精密度实验；结果见表1。

5.准确度：按回<