关键词： 聚合酶链反应杂交念珠菌属

【摘要】目的研究以非培养为基础的快速检测与鉴定念珠菌的方法。方法将白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌种特异探针加尾后固定在硝酸纤维素膜上；用氯化苄法提取念珠菌DNA，采用真菌特异通用引物PCR扩增DNA，在扩增过程中用Bio-11-dUTP标记扩增产物，然后分别与白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌特异探针杂交。结果对14种念珠菌扩增均为阳性，对3种常见细菌扩增均为阴性。3种念珠菌只与其对应探针杂交。结论该方法简便、快速、准确，适于临床实验室快速检测与鉴定念珠菌。

Rapid detection and identification of Candida species by PCR-reversed dot hybridization

ZHANG Junmin^*, zHOU Guimin, XIE Ling, et al.

^*Department of Microbiology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853

【Abstract】ObjectiveTo establish a non-culture method for detection and identification of Candida isolates from clinical specimens.MethodsThe species-specific probes to identify three Candida species, c.albicans,C.tropicalis and C.glabrata, were added homopolymer tails and then inoculated on a nitrocellulose filter. The benzyl chloride method was used for extracting template DNA from Candida isolates. The DNA from each isolate was amplified by PCR with the fungus-specific universal primers, and the PCR products labeled with bio-11-dUTP during amplification were hybridized with the species-specific probe.ResultsAll14 Candida species were amplified by PCR, and non-specific amplificatin for 3 bacteria species was found. The probes reacted with C.albican, C.tropicalis and c.glabrata didn′t react with other Candida labeled DAN.ConclusionPCR-reversed dot hybridization is rapid and simple for detection and identification of medically important Candida species.

【Key words】Polymerase chain reactionHybridizationCandida

念珠菌引起全身感染的增加，以及不同菌种对抗真菌剂所具有的不同天然耐药性^［1］，要求实验室不仅快速检出感染病原，而且还应准确鉴定到种，才能使临床有效控制感染。目前以培养为基础的传统分离鉴定方法，因需时较长常常延误诊断和治疗。为建立快速检测与鉴定念珠菌方法,我们利用真菌通用（fungus-specific universal）引物PCR，结合念珠菌种特异探针反向斑点杂交(reversed-dot hybri-daization)，对此进行了初步探讨，现报告如下。

材料与方法

一、材料

1.菌种：白色念珠菌 ATCC 14083、热带念珠菌981083（临床株）、光滑念珠菌 aTCC 710，以及其他11种临床常见念珠菌和金黄色葡萄球菌 ATCC25923、大肠埃希菌ATCC 25922、绿脓假单胞菌ATCC 27853。

2.真菌特异引物：引物1为5′-GCATCGATGAA-GAACGCAGC-3′，引物2为5′-TCCTCCGCTTATTGAT-ATGC-3′。种特异探针分别为：白色念珠菌，ATTG-CTTGCGGCGGTAACGTCC；光滑念珠菌，TAGGTTTT-ACCAACTCGGTGTT；热带念珠菌，AACGCTTATTTT-GCTAGTGGCC。引物及寡核苷酸探针参照文献［2］，由军事医学科学院国家生物医学分析中心DNA合成和序列分析实验室合成。

3.Bio-11-dUTP，购自北京医科大学药学院。

4.末端脱氧核苷酸转移酶，购自北京北方同正生物技术发展公司。

二、方法

1.寡核苷酸探针加尾：5×Buffer 40 μl，10 mmol/L dTTP 20 μl、15 u/μl TdT 3 μl、10 nmol/L寡核苷酸探针2 μl去离子水135 μl。混匀后放37℃孵育2小时。

2.交联：分别取3种加尾后的寡核苷酸探针点硝酸纤维素膜，每点5μl，待吸附后将膜放入交联仪中，能量 2 000 μJ/cm²，2分钟。

3.预杂交：用5×SSC＋0.5％SDS，在55℃洗膜30分钟后，再用封闭液与膜在37℃作用30分钟。此膜可立刻使用，也可干燥后备用。

4.念珠菌DNA提取：采用氯化苄法^［3］。

5.PCR反应：总体积25 μl：Tris-HCl：10 mmol，pH 9.0，KCl 50 mmol，MgCl₂2.5 mmol，Triton X-100 0.1％、dATP、dGTP、dCTP各200 μmol，dTTP与Bio-11-dUTP合计200μmol（dTTP与Bio-11-dUTP比例为2∶1）、引物1和2各1 μmol、Taq DNA酶1.5U(宝泰科生物技术公司)，DNA模板2μl。94℃预变性7分钟，94℃变性1分钟、55℃复性1分钟、72℃延伸1.5分钟，共30个循环。最后72℃再延伸6分钟。取12μl行1.5%琼脂糖凝胶电泳。

6.杂交：PCR扩增产物95℃变性10分钟后立刻放冰浴1分钟以上。将点有3种探针的硝酸纤维素膜放入杂交袋中加1 ml杂交液（5×SSC，2×Denhardt′s液、变性鲑鱼精DNA 190 μg/ml），12μl变性PCR扩增产物。密封后放37℃杂交60分钟。用2×SSC＋0.5％SDS室温洗2次，每次3分钟；0.2×SSC＋0.5％SDS室温洗1次，3分钟；0.2×SSC＋0.5％ SDS 37℃洗1次，5分钟。

7.加酶：Avidin-HRP用稀释液按1∶100配制（稀释液成分与封闭液相同，只是将2％BSA的浓度调整为0.1％即可）。将1 ml稀释的Avidin-HRP加入杂交袋中与硝酸纤维素膜在37℃作用30分钟。用稀释Avidin-HRP的稀释液室温洗膜2次，每次3分钟。再用0.1 mol Tris.Cl pH9.5＋1mol NaCl＋2 mmol MgCl₂洗膜2次，每次3分钟。

8.显色：将6 mg 3，3′-二氨基联苯胺四盐酸盐溶于10 ml 0.1 mol/L Tris.Cl (pH7.5)＋0.15 mol/L NaCl中，再加30％H₂O₂10 μl，将硝酸纤维素膜放入并在暗处显色10～15分钟。

结果

对14种临床常见酵母样真菌，包括白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、高里念珠菌、乳酒念珠菌、克柔念珠菌、解脂念珠菌、葡萄牙念珠菌、新型隐球菌、异常汉逊酵母菌、酿酒酵母菌、红酵母菌、白地霉菌，用真菌特异引物PCR扩增，均扩增出一条DNA带，但其在琼脂糖上的电泳迁移速度不同。用8%聚丙酰胺凝胶电泳，与PBR322 hinfⅠDNA marker比较，14种念珠菌扩增片段大小在260～420 bp之间，其中白念珠菌为330 bp，光滑念珠菌为410 bp，热带念珠菌为325 bp。用该引物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、绿脓假单胞菌DNA提取物扩增，结果均为阴性。

对白色念珠菌、光滑念珠菌和热带念珠菌的检测与鉴定，我们做了4组PCR扩增和杂交，其中3组是对3种菌分别扩增和杂交，第4组对3种菌的DNA混合物进行扩增和杂交。结果用白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌扩增产物分别与其对应探针杂交，仅见与所鉴定菌探针杂交出现斑点，而与鉴定其他2种菌的探针无斑点出现。对3种菌混合DNA扩增，用1.5%琼脂糖凝胶电泳为2条DNA带（1条为光滑念珠菌扩增产物，另1条为白念珠菌和热带念珠菌的混合产物）。经杂交，3种探针均出现斑点，说明可检出此3种菌的混合感染。

讨论

以分子生物学为基础的非培养检测念珠菌方法，早期多采用种特异引物PCR对已知菌进行检测，其优点是PCR阳性即表明所测标本中含有该菌，如对白色念珠菌等的检测。不足之处是对已知菌检测阴性不能排除其他真菌感染的可能。加之PCR的高敏感性，也可能出现非特异扩增，这也使单纯PCR方法检测念珠菌的应用范围受到限制。

为克服种特异引物PCR的不足，近年引入了真菌通用引物 pCR，用此引物可扩增所有真菌，包括念珠菌的DNA^［2,4］，提高了检测真菌的范围。我们所用扩增念珠菌的引物选自真菌保守区5.8S rRNA和28S rRNA。试验结果表明该引物只扩增所试的14种念珠菌，对3种临床常见细菌均不扩增。通用引物PCR的缺点是阳性结果不能明确病原菌的种类。由于不同念珠菌对抗真菌剂的耐药性不同^［1］，只有将扩增结果鉴定到种水平，才能真正达到为临床提供准确的试验结果。因此，如何进一步将所测菌鉴定到种水平已成为目前研究的焦点。已报道的方法有限制性内切酶片段长度多态性^［4］、单链构象多态性^［5］、利用探针进行微孔板夹心杂交^［2］、荧光探针杂交^［6］等方法。其中以探针杂交法最具临床应用前景。该方法类似传统检验模式，即在最大限度检出标本中病原菌的基础上，对常见菌进行菌种鉴定。由于其简便、实用，且具有进行仪器自动化操作的可能，因此倍受重视。

我们尝试用反向斑点杂交作为鉴定方法，主要是考虑该法操作简便，无需特殊仪器设备。通常杂交方法为先标记探针，再与膜上靶DNA或DNA扩增产物杂交。反向斑点杂交则相反。探针经加尾后，可制备在硝酸纤维素膜上，经预杂交后干燥备用。其后操作只有杂交、加酶和显色。我们在试验中用封闭液代替预杂交液，省去了杂交后再进行封闭的步骤，可节省约1小时，使整个杂交过程可在2小时内完成，且不影响杂交结果。在PCR扩增中用生物素标记扩增产物，Bio-11-dUTP部分取代dTTP掺入到扩增产物中，标记无需特殊方法。杂交前扩增产物也不<