关键词： 脑梗死血小板蛋白激酶Cα-颗粒膜蛋白

【摘要】目的研究急性脑梗死血小板蛋白激酶C(PKC)对血小板活性的影响及其致病作用。方法利用单克隆抗体放射免疫法检测20例急性脑梗死患者血小板膜及血浆内α-颗粒膜蛋白(GMP-140)的量；以血小板膜蛋白的磷酸化程度表达血小板PKC的活性。结果患者组血小板膜及血浆内GMP-140量［分别为(1 075±234)分子数/血小板、(5.3±1.31)分子数×10¹⁰/ml］均较正常对照组［(724±298)分子数/血小板、(1.43±0.48)分子数×10¹⁰/ml］显著升高(均P＜0.001)；患者组血小板PKC基础活性(分子量为47 000及20 000蛋白质分别表达为4 190及2 318 cpm)及活化活性(47 000蛋白质于活化3分钟、10分钟时表达为5 319及7 010 cpm；20 000蛋白质对应时间表达为3 247及4 305 cpm)均较对照组(分子量为47 000及20 000蛋白质表达的基础活性分别为2 119及1 942 cpm；47 000蛋白质于活化3分钟、10分钟时表达的活化活性为2 608及3 213 cpm，20 000蛋白质对应时间表达的活化活性为2 489及2 824 cpm)显著升高(均P＜0.001)；血小板PKC活性与血小板GMP-140的表达存在着显著正相关的关系。结论急性脑梗死疾病中血小板PKC的高基础活性及高活化活性是血小板异常活化及血小板血栓形成的原因。

Platelet activity and its protein kinase C in acute cerebral infarction

HAO Yiwen^*, ZHANG Lixia, REN Yan, et al.

^*Department of Blood Transfusion, First Clinical College, China Medical University, Shenyang 110001

【Abstract】ObjectiveTo study platelet protein kinase C(PKC)′s effect on platelet activity and its role.MethodsPlatelet membrane and plasma α-granule membrane protein (GMP-140) were measured in 20 patients with acute cerebral infarction by monoclonal antibody radioimmunoassay. The platelet PKC activity was expressed by the phosphorylation of platelet membrane protein.ResultsThe GMP-140 level on platelet membrane ［(1 075±234) molecules/platelet)］ and in blood plasma ［(5.3±1.31) molecules×10¹⁰/ml］ for patient group (PG) were significantly elevated than those in control group (CG) ［(724±298) molecules/platelet, (1.43±0.48) molecules×10¹⁰/ml］(P＜0.001). The basic activity and activated activity for various minutes for platelet PKC were significantly increased in PG than those in CG (P＜0.001), 4 190 cpm vs 2 119 cpm expressed by a protein of 47 000 molecular weight, 2 318 cpm vs 1 942 cpm expressed by a protein of 20 000 molecular weight, 5 319 cpm vs 2 608 cpm for 3 minutes and 7 010 cpm vs 3 213 cpm for 10 minutes expressed by 47 000 protein, 3 247 cpm Vs 2 489 cpm for 3 minutes and 4 305 cpm vs 2 824 cpm for 10 minutes expressed by 20 000 protein. There was a positive correlation between platelet PKC′ activity and GMP-140′ expression.ConclusionThe high basic and activated activities for platelet PKC were the causes of unusual activated platelet and platelet thrombosis in acute cerebral infarction.

【Key words】Cerebral infarctionBlood plateletProtein kinase CAlpha-granule membrane protein

急性脑梗死是一种血小板血栓性的脑血管病。血小板活化在血栓形成的病理生理中起重要作用，而α-颗粒膜蛋白又是血小板活化的特异性标记，因此常用以表达血小板的活化程度。急性脑梗死患者中存在着血小板α-颗粒膜蛋白(GMP-140)的高水平表达现象^［1，2］，这说明在这类疾病中血小板呈异常活化状态，但其分子基础还不完全清楚。蛋白激酶C(PKC)是一种信息传递酶，血小板PKC激活后，使血小板膜上特定蛋白质磷酸化，这些蛋白质的磷酸化程度反映PKC的活性高低。作者从急性脑梗死患者血小板PKC活性变化的角度来观察其与GMP-140表达之间的关系，探讨这类疾病中血小板活化的分子基础及PKC的致病作用，进一步揭示急性脑梗死等血小板血栓性疾病的病理机制。

材料和方法

一、病例选择

病例选自1997年2～12月我院神经内科收治的未经任何治疗的急性脑梗死患者(病程在3天以内)。所有病例的诊断参照第二次全国脑血管病学术会议第三次修订的标准，并经CT和核磁共振显像证实。其中男15例，女5例，平均年龄(54±7)岁；同时选择抽血前1周未服过任何药物，年龄、性别与脑梗死组相配的(年龄±3岁)20名健康人作为对照组。

二、实验方法

1.主要试剂：³²P-NaH₂PO₄为中国原子能研究所产品，Sepharose 2B、凝血酶、低分子标准蛋白均购自美国Sigma公司，活化血小板表面标记(GMP-140)放免药盒及血浆GMP-140放免药盒均购自苏州医学院血栓研究室，丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠等电泳试剂均为国产分析纯。

2.标本采集：塑料注射器经肘静脉采血20 ml，其中1 ml血以1∶9依地酸二钠(EDTA-Na₂)抗凝。取0.5 ml抗凝血与等量固定剂(20 mmol/L戊二醛-3 mmol/L叠氮钠-PBS，pH 7.4)混合，室温放置30分钟，即为固定全血，待测血小板表面GMP-140。0.5 ml全血以3 000 r/min离心10分钟，分离上层血浆按上法固定后置-30℃保存，待测血浆内GMP-140。余19 ml血用ACD(1.5％枸橼酸，2.5％枸橼酸钠，2％葡萄糖)以6:1比例抗凝，立即混匀，待进行凝胶过滤分离血小板。

3.血小板分离及凝胶过滤：ACD抗凝血于1 000 r/min离心10分钟，上清液为富血小板血浆(PRP)，PRP经Sepharose 2B凝胶过滤得静止血小板。用血小板缓冲液(Glucose 5.5 mmol/L、Tris 15 mmol/L、NaCl 0.14 mmol/L，pH 7.4)调血小板浓度为1×10⁹/ml。

4.血小板质膜及血浆内GMP-140的测定：参照文献［2］及试剂盒说明，利用¹²⁵I-SZ-51直接放射免疫分析法测定血小板表面GMP-140分子数，利用二株抗GMP-140单抗¹²⁵I-SZ-51及¹²⁵I-S₁₂夹心法来测定血浆内GMP-140分子数。

5.血小板磷酸化反应：取前述血小板悬液1 ml，加入³²P-NaH₂PO₄(0.5～1 mci/ml)一起孵育90分钟，并间隔充以95%O₂、5%CO₂。孵育结束后，分装于1个空白对照管及2个反应管，反应管中加入凝血酶(2U/ml)，于反应3分钟、10分钟时以10%三氯醋酸(TCA)终止反应。洗涤除TCA及非标记³²P。反应物超声粉碎并加入含SDS的样品缓冲液，煮沸3分钟，离心得蛋白质沉淀物。

6.血小板蛋白多肽的电泳、放射自显影和放射性计数：将分离的血小板蛋白质样品以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离胶浓度为10%，浓缩胶浓度为3%。电泳后，考马斯亮蓝染色、脱色、真空干燥凝胶。干燥凝胶与X线片包埋一起于-20℃以下曝光。24～72小时后冲洗显影。将自显影后电泳凝胶上相应的蛋白带切下，液闪计数³²P放射活性。

7.统计学处理：患者血小板质膜及血浆中GMP-140、PKC的基础活性及活化活性与对照组的比较均采用两个样本均数t检验；血小板GMP-140的表达与PKC之间的关系采用相关系数进行分析。

结果

1.血小板数量变化：20例急性脑梗死患者血小板数［(234.2±84.2)×10⁹/L］与正常对照组［(228.8±89.1)×10⁹/L］比较差异无显著意义。

2.血小板GMP-140的表达：20例急性脑梗死患者血小板膜表面GMP-140的分子数(1 075±234)分子数/血小板及血浆中GMP-140的浓度(5.3±1.31)分子数×10¹⁰/ml与正常对照组［(724±298)分子数/血小板、(1.43±0.48)分子数×10¹⁰/ml］比较，P＜0.001，差异有显著意义。

3.血小板PKC作用底物：从放射自显影的图像上可以看到急性脑梗死血小板PKC活化后磷酸化作用的主要底物是分子量为47 000、20 000的蛋白质，其次是分子量为40 000、72 000、90 000的蛋白质等(图1)。

4.血小板PKC活性变化：脑梗死组血小板PKC在无凝血酶作用时(即0分钟)的基础磷酸化作用的底物分子量为47 000、20 000蛋白质的放射活性值及血小板PKC经凝血酶活化作用3分钟、10分钟时这些蛋白质的放射活性值见表1。从表1可以看到，在相同时间位点上，脑梗死组的血小板蛋白质的放射活性值皆比正常对照组显著升高(P＜0.001)。分子量为47 000、20 000的蛋白质在两组中皆呈现磷酸化程度及放射活性随反应时间延长而增强的趋势，且脑梗死组这一现象比正常对照组表现得更加明显，见图2、3。

图1脑梗死组及对照组血小板膜蛋白磷酸化后的放射自显影图象

表120例对照组及脑梗死组底物蛋白磷酸化放射活