关键词： 红细胞受体，补体红斑狼疮，系统性

【摘要】目的为临床常规检验和进一步研究红细胞补体受体1型（ECR1），建立一种敏感、特异和重复性良好的定量测定方法。方法戊二醛固定红细胞，并定量“液相包被”于V型板中，依次加入抗CR1单克隆抗体、碱性磷酸酶（AP）标记二抗及可溶性底物显色，移显色液于比色孔，405 nm比色，计算吸光度值（A）。结果正常人ECR1分子表达数量A值平均值为1.26±0.35，显著高于肝细胞癌（0.87±0.21）和系统性红斑狼疮(0.42±0.16)等患者（t=8.62，P＜0.01），差异有非常显著意义；系统性红斑狼疮患者ECR1分子表达的数量显著低于肝细胞癌患者(t=11.27，P＜0.01)，差异有非常显著意义，并且ECR1数量表达与狼疮疾病活动和治疗效果显著相关。结论本方法具有良好的敏感性、特异性和重复性；CR1分子的数量表达可分为高、中、低三种形式；肿瘤患者的中、低表达显著升高，狼疮患者无高表达形式。

Quantitative assay of complement receptor type 1 expressed on erythrocytes

WANG Haibin^*, ZHANG Jingping, SHEN Qian, et al.

^*Department of Immunology, Changhai Hospital, Shanghai 200433

【Abstract】ObjectivesTo develop a highly sensitive and reproductive test for the number of complement receptor 1 on erythrocytes (ECR1), and to investigate the significance of ECR1 in immune-relative diseases.MethodsGlutaraldehyde-fixed red blood cell (RBC) was analysed in V well microtitre plates. To the cell buttons in each well mouse monoclonal anti-CR1 of the first antibody, second antibody of anti-mouse IgG conjugated to alkaline phosphatase and the substrate was added following three washes in S/BSA. The supernatant was transferred to a clean U microtitre plate to facilitate reading in a plate reader at 405 nm (A).ResultsECR1 of the diseases of hepatocellular cancer (0.87±0.21) and systemic lupus erythrematosus (0.42±0.16) was significantly lower than that of healthy individuals (1.26±0.35). The ECR1 of systemic lupus erythrematosus was obviously lower than that of hepatocellular cancer (t=11.27,P＜0.01). ConclusionsThe technique can examine the number of CR1 on RBC. The number of CR1 can be divided into high, middle and low forms. The middle and low expression of ECR1 was obviously increased in the diseases of cancer, and there is no high expression in the diseases of systemic lupus erythrematosus.

【Key words】ErythrocyteReceptors, complementLupus erythematosus, systemic

目前，国内对红细胞(RBC)补体受体1型（ECR1）分子所致的免疫粘附功能的研究，主要采用RBC花环法。国外测定方法较多，主要有流式细胞仪、同位素标记和酶联^［1］等测定方法。鉴于我国国情和目前研究状况，我们根据细胞酶联原理建立了ECR1分子定量测定方法。此方法的建立，使ECR1的测定进入到分子定量水平，为进一步探讨ECR1分子在发病过程中的意义提供重要研究手段。

材料和方法

1.血标本： 65例肝细胞癌（HCC），系我校东方肝胆医院住院确诊患者；24例系统性红斑狼疮（SLE）为长海医院住院确诊患者。对照组88例，取自体检健康人群。取依地酸（EDTA）抗凝血1 ml在采血后6小时内试验。

2.缓冲液：为pH7.2的磷酸盐缓冲液（PBS），1%等渗生理盐水/牛血清白蛋白（S/BSA）和10% PBS/BSA。

3.RBC制备：抗凝血用PBS 洗涤4次（离心400转/分，5分钟）；每次弃净上清。取0.1 ml RBC，加入0.9 ml S/BSA 和0.1 ml用PBS配置的戊二醛，置室温30分钟。S/BSA 洗涤1次，PBS 配成2%的悬液，存于-70℃，备用。

4.免疫试剂和底物：鼠抗人CR1 单抗（E11克隆，晶美公司），碱性磷酸酶(AP)标记的羊抗鼠IgG；底物：即用即配，余者不用。

5.测定方法：储存的RBC在室温溶解，使用前充分混匀。（1）用200 μl S/BSA 预湿V 型板孔5分钟，甩净叩干。加2%的RBC悬液20 μl，用160 μl S/BSA洗涤1次（离心1 500转/分，5分钟），弃上清并轻轻叩干，以勿丢失RBC为准。每次洗涤后都应将板底RBC用震板器充分震起。（2）加 一抗、酶标二抗，37℃，50分钟。设立空白对照和绵羊红细胞(SRBC)阴性对照。S/BSA洗涤3次。（3）加20 μl S/BSA及40 μl底物；37℃，90分钟；每隔20 分钟震动1次。（4）每孔加入PBS 60 μl，离心，吸上清液100 μl移入另一干净U型板，测A₄₀₅值；标本的A值与空白对照孔A值之差即为测定值。复孔A值求其平均数。

结果

1.对照测定。（1）阴性对照：等体积的SRBC阴性对照值持续较低，其范围为：0.129～0.202（0.180±0.029），变异系数（CV）为0.161；说明SRBC内存在少量内源性AP，且不同绵羊之间存在一定的差异。（2）空白对照：用BSA/PBS代替一抗，测得值持续较低，范围为0.160～0.224(0.202±0.026)，CV为0.128。(3)RBC内源性AP：测定值范围是0.114～0.225（0.167±0.020），CV为0.119；结果表明，虽然不同个体之间RBC内源性AP含量存在一定程度的差异，但由于其含量甚微，从方法学考虑并不影响整个试验结果。

2.重复性测定。用体检健康者和不同患者的RBC分别进行板间和板内四复孔试验。结果表明，板内CV值是0.006；板间CV值是0.008。表明此方法具有极好的重复性。

3.测定曲线及灵敏度。将RBC按原测定数的100%、90%、80%……10%等每10个百分点进行稀释，然后设四复孔进行定量测定。正常人、HCC及SLE患者的A值随RBC数量的减少呈线性下降，曲线间呈良好的平行关系，在50%稀释处其A值大约为100%的1/2。可测及3×10⁵RBC CR1分子的变化，具有良好的灵敏性。

4.临床应用。（1）健康体检的筛选：对照组88例(1.26±0.35)中68例（77.3%）ECR1值＞1.00，但尚有20例（22.7%）＜1.00，其中＜0.60者5例。进一步检查表明，此5例中有3例为慢性乙型肝炎肝硬化早期，1例为HCC患者，另1例未查出异常。（2）临床辅助诊断：HCC和SLE患者的ECR1数量表达低于正常人（t=8.62，P＜0.01），特别是SLE患者(0.42±0.16)，其ECR1数量表达极低于HCC（0.87±0.21，t=11.27，P＜0.01），差异均有非常显著意义，24例患者无一例ECR1数值高于1.00。

讨论

用完整的RBC，而不将RBC粘附在微量滴定板孔上，然后进行酶联试验，这种“液相定量”包被，不但使RBC膜上CR1分子充分暴露，与抗体充分接触，且使测定具有良好的准确性和重复性。经戊二醛固定的RBC，不但能耐受酶显色的碱性环境，而且还可冻存（-70℃）。这样既能集中进行试验，减少试验中的误差，又能进行不同病期的动态观察。此外，RBC经过戊二醛固定以后，在洗板过程中能牢固包被在V型板上，保证洗板中无RBC的丢失，这是测定结果重复性良好的重要条件^［2］。

CR1分子具有许多重要的生物学功能^［3］。对RBC CR1分子数量表达状况进行研究具有重要的基础与临床意义。结果表明，对体检人群进行ECR1分子数量测定具有重要的疾病筛选价值。正常人ECR1分子的数量表达显著高于HCC和SLE患者，而SLE患者ECR1的数量表达显著低于HCC患者，且无一例狼疮患者ECR1数量超过1.00。因此，对SLE患者不同病期进行ECR1分子定量测定，更具有重要的临床价值。

本课题受国家自然科学基金资助（编号：39670754）

参考文献

[1]Jones DRE, Thompson S, Amirchetty S, et al.An enzyme-linked immunosorbent assay for complement regulatory proteins and membrane-bound immunoglobulins on intact red blood cells. J Immunol Methods, 1994,177:235-242.

[2]Thomsen B, Niesen H. Microtitre plate enzyme-linked immunosorbent assay for measuring C3b receptors on human erythrocytes. J Immunol Methods,1985,81:259-267.

[3]赵修竹，主编.补体学.武汉：湖北科学技术出版社，1998.145-149.

(收稿：1999-05-20修回：1999-08-25)