关键词： 神经根炎聚合酶链反应受体，抗原，T细胞

【摘要】目的通过研究急性吉兰巴蕾(格林巴利)综合征患者外周血T淋巴细胞受体(TCR)-β链基因的重排情况，以进一步对其基因扩增产物进行序列分析。方法分离6例患者外周血T淋巴细胞，用异硫氰酸胍-酚-氯仿法提取细胞总RNA。合成双链cDNA，用T₄DNA聚合酶补平末端，在T₄DNA连接酶的作用下进行环化。环化的DNA直接用作反向聚合酶链反应(IPCR)的模板。扩增产物在1.8%的琼脂糖凝胶上进行电泳分离，溴化乙锭染色。结果对每份患者标本均可以较好地扩增出重排的TCR-β链基因，而正常人组则未能扩增出任何产物。在反应中连接体系的cDNA浓度对IPCR的影响较大，过高的cDNA浓度使有效的自身环化降低，而导致扩增效率的下降。结论用IPCR技术可以特异地扩增重排的未知的TCR-β链基因，该方法具有特异性高，易于操作的优点。

Inverse polymerase chain reaction amplification of T cell receptor β-chain genes.

WANG Lijun^*, zHONG Yanfeng, KANG Dexuan, et al.

^*Department of Neurology， 3rd hospital of Beijing Medical University, Beijing, 100083

【Abstract】ObjectiveTo amplify the TCR-β chain genes from peripheral blood lymphocytes (PBL) of patients with Guillain-Barre syndrome(GBS). MethodsPeripheral blood leukocytes were obtained from 6 patients with GBS and five healthy donors separately by lymphocyte separation medium. Total RNA was extracted by the acid-guanidium thiocyanate-phenol-chloroform method. cDNA was synthesized using the cDNA synthesis system (Gibco BRL) and then blunt-ended using DNA polymerase. The T₄ dNA ligase circulated double strand cDNA was used as the template for IPCR reaction. Amplified IPCR products were evaluated by 1.8% agarose gel electrophoresis and ethidium bromide staining.ResultsPeripheral blood lymphocyte samples from 5 of 6 patients with GBS showed productive TCR β chain gene rearrangements. In a similar analysis of 5 healthy donors, we could not observe any productive rearrangements. The concentration of cDNA in circulation was very important for iPCR amplification. High cDNA concentration promoted intra-molecular ligation, thus decreased effective self circulation and affected amplification efficiency. it is important to optimize the protocols of IPCR for specific amplification.ConclusionIPCR is a useful method to evaluate unknown variable segments of rearranged TCR genes. It is easy to set up with high specificity of amplification due to both specific primers.

【Key words】RadiculitisPolymerase chain reactionReceptors, antigen, T-cell

在自身免疫性疾病的发病机制中，活化的T淋巴细胞起着重要的作用。致病性T细胞受体(T-cell receptor, TCR)有特异性基因重排，呈一定的限制性^［1,2］。T细胞通过TCR识别抗原，TCR基因通过V-D-J-C区的重排显示出多种特异性。在特定的抗原刺激下，特异性T细胞被激活并增殖形成相应的克隆。因此，分析TCR基因显得极为重要。目前采用的各种方法都有一定的局限性。我们利用一种反向聚合酶链反应(IPCR)的新技术成功地对吉兰巴蕾(格林巴利)综合征(GBS)患者外周血淋巴细胞中TCR-β链基因进行了有效扩增，可较为客观、全面地检测到TCR-β链的基因重排情况，在此基础上可进一步对IPCR的扩增产物进行基因克隆及序列分析。

材料和方法

1.标本来源：吉兰巴蕾综合征6例，为我科住院患者，经临床、电生理及病理学检查确诊。发病1周内取外周抗凝血，另取5名正常人作为对照。

2.总RNA的提取：用淋巴细胞分离液从外周血分离淋巴细胞，异硫氰酸胍法提取总RNA^［3］，测吸光度A_260/280，对RNA定量并分析纯度，甲醛变性凝胶电泳检测RNA的完整性。

3.双链cDNA的合成及环化：双链cDNA的合成采用Gibco公司的cDNA合成系统^［4-6］，分别用0.5、1、2 μg的总RNA，加Oligo(dT)_12-18随机引物，在鼠源反转录酶(MMV)200 u的作用下，37℃水浴1小时进行反转录，合成cDNA第1链，反应体系为20μl。随后进行cDNA第2链的合成，10×第2链缓冲液16 μl，加DNA聚合酶20 u，核糖核酸酶(RNase)H 1.4 U（无RNase活性），DNA链接酶5 U，加无RNA酶水至终反应体系160μl，16℃水浴2小时，合成cDNA第2链。加T₄DNA聚合酶2 U（Biolab公司），14℃水浴30分钟，将双链cDNA末端补平，酚∶氯仿抽提，乙醇沉淀。将沉淀溶于水后，在T₄DNA连接酶（Promega公司）2 U的作用下，16℃环化2～24小时，设不同的反应体系，对环化结果进行比较分析，经65℃水浴15分钟后备用作 iPCR 的模板。

4.IPCR：用于 IPCR扩增的引物由北京赛百盛公司合成，正向引物：5′-GTGCGTCGACGTGTGCACC-TCCTTCCCATT-3′，反向引物：5′-TGTAGAATTCG-CCATGGTCAAGAGAAAGG-3′。取环化产物为模板在50μl反应体系中进行IPCR扩增，反应参数为：95℃变性5分钟，加Taq酶2.5 u，80℃保温10分钟，然后95℃变性40秒，60℃退火40秒，72℃延伸1分钟，共35个循环，最后一个循环延伸时间为7分钟，保证扩增产物充分延伸。扩增产物经1.8%的琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色，紫外灯下观察结果，记录并照相^［4-6］。

结果

提取的总RNA经甲醛凝胶变性电泳显示有18S和28S两条带，表明所提取的RNA无降解。对6例GBS患者IPCR扩增结果表明，用该方法可以较好地扩增出重排的TCR-β链基因，而正常人组则未能扩增出任何产物。用1μg和2 μg总RNA反转录合成的cDNA，经IPCR可扩增出重排的基因片段，而用0.5μg的RNA者，则未能得到相应的PCR产物。

不同的环化反应体系对IPCR的结果有一定的影响。在cDNA量一定时，100μl环化反应体系的产物扩增效率较高，而将体系改为25 μl、50μl和300 μl时，扩增效率则明显降低，产物的特异性差，甚至检测不到扩增产物。

不同的环化时间对扩增反应也有影响。在2、8和16小时3个时间段，随着时间的延长，扩增效率增高，而在16小时后则不再有明显差别。

讨论

IPCR是一种用来扩增已知序列外侧未知基因的新技术。TCR-β链基因各区的排列顺序为V-D-J-C，其中C区为恒定区，在基因重排中保持稳定不变。基于此，我们利用已知的C区基因的序列，设计一对反向引物，提取外周血淋巴细胞总RNA，通过逆转录制备双链cDNA，将其补平后环化，使待扩增的V-D-J区基因位于一对反向引物的中间，以此为模板进行IPCR扩增。通过对扩增产物的分析得知，在GBS急性期存在TCR-β链基因特异性重排，在疾病的后期重排趋势发生了改变。对慢性炎性脱鞘性多神经根神经炎的IPCR扩增，也发现有不同的重排改变，而对正常人和非自身免疫性疾病患者的IPCR扩增则未发现有TCR-β链基因的重排。对部分IPCR扩增的基因进行测序表明，IPCR技术可以成功地扩增出重排的基因。

IPCR技术根据已知的基因序列设计一对反向引物，在分别合成双链cDNA的基础上，经过一个环化过程使得被扩增的基因序列位于反向引物之间，即使在环化的cDNA之间的序列是未知的，也仍然可以通过该技术扩增。同时由于使用了一对特异的引物，经过同一个PCR反应，反应条件完全一致，因而可以避开上述两种方法的限制，特异地扩增出所有重排的TCR-β链基因，准确地反映基因重排的情况，并可以进行比较，还可以进一步对产物进行基因克隆和序列分析。

我们发现，在反应过程中总RNA的量、环化反应体系的大小以及反应时间都会影响扩增的效率。当总RNA的量少至0.5μg时，无法扩增出能检测到的PCR产物。可能是因为此时目的cDNA浓度极低，而且由于平端连接的效率本来就低，从而使形成的有效模板太少的缘故。cDNA的环化对IPCR的扩增效率影响较大，在一定的条件下，100μl环化体系的IPCR扩增效率最高，这可能与cDNA的浓度有关。环化体系过小时，较高的cDNA浓度促进了分子间的连接，形成串联体，而有效的自身环化减少，从而使扩增的效率和特异性都大大降低。过大的环化反应体系又使得cDNA的浓度过低，环化的模板量减少也会导致IPCR扩增失败。

总之，IPCR可扩增未知TCR-β链基因，通过一次IPCR可以扩增出所有重排的基因，而不必分别进行常规的PCR反应，因而可以进行横向比较。由于使用了一对特异反向引物，因此具有较好的特异性。IPCR技术除了可扩增TCR-β链基因外，还可用于TCR-α、γ和δ链的研究^［7］。并可用类似的方法来分析和克隆已知基因邻近的多种未知基因，如染色体的步移等。

本课题受卫生部科研基金资助(编号：96-1-287)

参考文献

[1]Hartung HP，Pollard J，Harvey G，et al. Immunopathogenesis and treatment of the Guillain-Barre syndrome. Muscle<