关键词： 流式细胞术细胞周期脱噬作用

【摘要】目的以流式细胞术法简便、有效地检测凋亡和坏死细胞。方法将热处理、喜树碱诱导和紫外线诱导的急性早幼粒白血病细胞株(HL-60)细胞分别用碘化丙锭(PI)摄入试验、亚G1峰法和DNA链缺口标记法(TdT)进行检测，并与对照组细胞进行比较，观察三种方法在凋亡和坏死细胞检测中的应用情况。结果PI摄入试验显示，死细胞可大量摄取染料，DNA含量直方图上其相对荧光强度明显较活细胞高；凋亡细胞在经磷酸-柠檬酸盐缓冲液(PC)处理后，G1期峰前出现一额外亚G1峰而被识别，未经PC处理的细胞难检测到凋亡；TdT标记时，坏死细胞平均荧光强度约为对照的3倍，而凋亡细胞荧光强度明显增加。结论将PI摄入试验、亚G1峰法和TdT法结合起来，可有效检测凋亡和坏死细胞。

DNA content analysis and DNA strand breaks labelling method for detecting necrotic and apoptotic cells

TAO Deding, SHU Dan, GONG Jianping.

Molecular Medical Center ,Tongji Hospital, Tongji Medical UniversityWuhan 430030

【Abstract】ObjectiveTo detect necrotic and apoptotic cells effectively and simply by flow cytometry.MethodsNecrotic or apoptotic HL-60 cells which were induced by thermodynamics, camptothecin and ultraviolet radiation were analyzed with propidium iodide(PI) absorption test,Sub-G1 and TdT method. The effect of the methods were compared.ResultsDeath cells absorbed a mass of PI. The relative fluorescence intensity was higher in death cells than in live cells on DNA histogram. Apoptotic cells treated with phosphate-citric acid buffer (PC) were distinguished by extra Sub-G1 peak ahead of G1 peak on DNA histogram, but it was difficult to detect apoptosis for those not treated with PC. After labelled with TdT method, the mean fluorescence intensity of necrotic cells was 3-fold of the control, meanwhile, the mean fluorescence intensity of apoptotic cells increased apparently.ConclusionWe can detect necrotic and apoptotic cells efficiently by the method of PI uptake,Sub-G1 and TdT.

【Key words】Flow cytometryCell cycleApoptosis

目前，细胞凋亡的检测方法很多，流式细胞术无疑是分析凋亡的重要手段。最常用的方法，是以DNA含量分析为基础的亚G1峰法和利用外源末端脱氧核苷酸转移酶对DNA链缺口进行标记的方法（TdT），且常单独使用。已知的任何一种流式细胞术的细胞死亡检测方法，均是根据死亡细胞的某一具体特征而建立起来的，在应用过程中常会受到方法自身局限性的限制，遇到如何区分凋亡和坏死的问题。我们将DNA含量分析和TdT法同时用于分析凋亡和坏死细胞，报告如下。

材料与方法

1.试剂：喜树碱（CAM，Sigma产品），TdT试剂盒（宝灵曼产品）。

2.仪器：美国BD公司FACSort流式细胞仪。

3.细胞培养和处理：人类早幼粒细胞急性白血病细胞株(HL-60，购自美国ATCC公司)用常规方法培养，取对数生长期细胞进行实验。将细胞分为对照组、热处理组（53℃水浴处理30分钟）、CAM诱导组（以0.15 μmol/L CAM诱导培养3小时）、紫外线(UV)照射组（20秒，培养4小时）。

4.染色：收集细胞，然后将每组细胞平分为3份进行染色。(1)新鲜细胞：直接加入1 ml不含辛基酚聚乙二醇醚(Triton X-100)的碘化丙锭(PI)染液（50 mg/L PI，100 mg/L 核糖核酸酶），室温避光反应30分钟上机。(2)Hanks平衡盐溶液(HBSS)处理细胞：将固定细胞用HBSS洗涤，加入1 ml含10 g/L Triton X-100的PI染液染色上机。(3)磷酸-柠檬酸盐缓冲液（PC）处理细胞：按文献［1］方法处理。

5.TdT标记：取固定细胞，按TdT试剂说明及文献［2-4］方法进行标记。

结果

1.DNA含量分析：用FACSort流式细胞仪，以正常人外周血淋巴细胞对检测条件进行调试，以此条件进行DNA含量检测。结果显示，热处理细胞除少数表现为仅摄入低剂量PI外，绝大部分细胞PI摄取明显较对照、CAM和UV处理细胞高，可见热处理细胞对PI通透性增加，说明热处理可致细胞死亡。固定细胞不经PC缓冲液处理，对照组、热处理组、CAM和UV诱导组细胞DNA含量的直方图相似，诱导组检测不到凋亡。固定细胞在经PC处理后，诱导组细胞G1期峰前出现一额外亚G1峰，并分别伴随S期和G1期细胞明显减少，说明CAM和UV分别专一性地诱导S期和G1期的细胞凋亡。

2.TdT法：以参数荧光1高度对数放大检测异硫氰酸荧光素(FITC)荧光强度，以参数荧光3面积检测DNA含量。检测结果见图1。

图1不同方式处理的HL-60细胞TdT标记情况

图1结果显示，与对照组细胞相比，热处理细胞参数荧光1强度有所改变，阳性标记细胞平均荧光强度约为对照组细胞的3倍，而UV和CAM诱导的阳性细胞荧光强度明显增加，约为对照组细胞的10～25倍，可见热处理细胞的DNA链也存在少量缺口，在TdT的作用下也有溴脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(BdrUTP)的掺入。在对数放大的情况下，参数荧光1平均荧光强度与对照组相比,增加不明显的细胞不能明确判定为凋亡细胞，必须结合其他方法分析判断。

讨论

死细胞区别于活细胞的特征之一是质膜转运功能的丧失，以及膜结构完整性的丢失。具体表现在它们对阳离子如PI的摄取能力不同^{［2，5，6］}，活细胞或膜结构完整的凋亡细胞对PI拒染，仅表现为低剂量的摄入；相反，死细胞可以大量摄取PI并与核DNA结合，在DNA直方图上，其相对荧光强度明显高于膜结构完整的细胞。

凋亡细胞的检测方法很多，由Gong等^［1］在DNA含量分析基础上经改进而建立的亚G1峰法，是目前应用最为广泛的凋亡分析方法之一。该法简便易行。凋亡细胞经固定后，再经高渗PC缓冲液处理，可加大细胞的通透性，促使核小体间DNA链断裂形成的小分子DNA片段由胞内渗出，细胞内DNA含量明显降低，在G1期峰前以亚G1峰的形式出现而被识别。坏死细胞由于DNA链的不规则降解，在G1峰前以楔型峰的形式出现。不经PC处理的凋亡细胞由于细胞的通透性较低，DNA片段难以由胞内渗出，在DNA直方图上不易被识别。亚G1峰法假定DNA含量低于G1期细胞的物质为凋亡细胞，特异性不高。另外，对于早期凋亡细胞而言，断裂的DNA片段较少或分子量较大，对亚G1峰法并不适用，须用DNA链缺口的原位标记技术检测。

TdT法被认为是目前最为特异的凋亡检测方法。该法可选择性地优先标记凋亡细胞，结合DNA含量分析，还可以用于凋亡细胞的细胞周期定位分析。但由于TdT法标记步骤较多，可能会出现假阳性结果；另外，伴随坏死出现的DNA链断裂在TdT的作用下也可表现出一定程度的阳性标记。因此，TdT法不能单独用于凋亡和坏死细胞的检测，须结合其他检测方法。

参考文献

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(收稿：1999-04-30修回：1999-09-09)