关键词： 岩藻糖苷酶；肝细胞肝癌

【摘要】目的合成α-L-岩藻糖苷酶新色原底物2-氯-4-硝基苯-α-L-岩藻糖苷，并以此底物为基础建立α-L-岩藻糖苷酶的速率检测法。方法以L-岩藻糖为原料，采用Westphal-Feier合成法制备底物2-氯-4-硝基苯-α-L-岩藻糖苷；研究α-L-岩藻糖苷酶作用于此底物的动力学性质，建立α-L-岩藻糖苷酶速率检测法。结果成功地制备了α-L-岩藻糖苷酶的新底物2-氯-4-硝基苯-α-L-岩藻糖苷，首次建立了α-L-岩藻糖苷酶速率检测法。血清α-L-岩藻糖苷酶作用于此底物的最适pH为4.8，米氏常数为0.23 mmol/L，至少在6分钟观测时间内吸光度变化与时间成比例，相当高浓度的抗坏血酸、血红蛋白、胆红素对酶活性测定不产生干扰，与对硝基苯-α-L-岩藻糖苷终点法的相关系数为r=0.950 1(n=32)，批内精密度相对标准差≤2.6%，正常参考值为(27.1±12.8) U/L(±2s)。结论以新底物为基础建立的α-L-岩藻糖苷酶速率检测法克服了以往检测法的缺陷，操作简便，适用于各种类型的自动生化分析仪，便于临床应用。

Synthesis of a novel substrate and kinetic rate assay for alpha-L-fucosidase.

LI Xingmin^*, SI Yikang, YANG Shude.

^* National Center for Clinical Laboratories, Beijing 100730

【Abstract】ObjectiveTo synthesize a novel substrate of alpha-L-fucosidase (AFU) and developa kinetic rate assay method for alpha-L-fucosidase by the novel substrate.Methods The novel substrate was prepared by the method of Westphal & Feier and AFU kinetic characters on the new substrate were studied. The kinetic rate assay method was evaluated.Results The kinetic rate assay method for determining alpha-L-fucosidase was developed. Optimum pH was 4.8; michaels-Meten constant (Km) was 0.23 mmol/L for serum sample and 0.28 mmol/L for AFU from human placenta. The course of zero order reaction sustained at 6 minutes. The concentration of ascorbic acid up to 6 g/L had no effect on the determination of AFU activity, nor on hemoglobin up to 230 mg/L or bilirubin up to 250 mg/L. The reference interval (±2s) for healthy subjects was 14.3～39.9 U/L. AFU activity was determined in a wide range （0～244.5 U/L） and with high sensitivity.Conclusion The kinetic method surmounted defects of previous methods for determining AFU activity. Unlike conventional methods, this method does not require any blank determination, and it can be performed with various types of automated analyzers.

【Key words】FucosidaseHepatocellular carcinoma

α-L-岩藻糖苷酶（Alpha-L-fucosidase, AFU），全称α-L-岩藻糖苷水解酶(Alpha-L-fucohydrolase, AFU; EC 3.2.1.51)，是一种存在于生物体内的酸性水解酶。近年来的研究认为，血清α-L-岩藻糖苷酶在诊断肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)方面有重要价值^［1-4］。因此，建立一种方便适用的AFU检测方法有着重要意义。

目前用于AFU测定的方法主要有两类：(1)4-甲基伞形酮-α-L-岩藻糖苷为底物的荧光法^［5］。(2)对硝基苯-α-L-岩藻糖苷为底物的比色法^［6］。前者检测灵敏度高，适用于微量生物样品(如活检组织、分离细胞、脊液和泪液等)以及极低AFU活性的样品(如岩藻糖苷储积病之标本)的分析，但此法不仅需要凝胶过滤除去干扰物质，而且需要荧光分光光度计，使常规应用受到限制；后者为临床上主要采用的方法，它系以对硝基苯-α-L-岩藻糖苷(Para-nitrophenyl-alpha-L-fucopyranoside, PNPF)为底物，在pH 5.0经AFU水解产生对硝基酚(Para-nitrophenol, PNP)。因PNP于此pH下在可见光区无光吸收，水解反应完成后，尚需以碱性缓冲液终止反应并显色，此测定原理决定了该法用于血清AFU活性的测定必为终点法，而无法采用速率法，且需设样本空白以排除本底的干扰，操作繁琐。

1992年，Koichi等首次合成了2-氯-4-硝基苯-α-L-岩藻糖苷(2-Chloro-4-nitrophenyl-alpha-L-fucopy-ranoside, CNPF) ，经过对其仔细研究，发现其合成方法有许多不确切之处，不能重复，遂对其进行了改进，制备出了高纯度的CNPF，并以其为底物首次建立了AFU的速率检测法。

材料和方法

一、糖苷合成

将10 g岩藻糖加入到装有84 ml乙酸酐和108 ml吡啶的烧瓶中，乙酰化反应48小时。然后将反应液倾入冰中，搅拌4小时，用氯仿抽提后，以无水硫酸镁干燥，蒸去氯仿得O-1,2,3,4-四乙酰-岩藻糖14.3 g，产率70.6%，熔点(91.1～93)℃，将O-1,2,3,4-四乙酰-岩藻糖10 g、2-氯-4-硝基酚(2-Chloro-4-nitrophenol, CNP)52 g和氯化锌16 g加入反应瓶中，搅拌下，加热至(160℃)反应30分钟。以50 ml二甲基甲酰胺和1 L二氯甲烷，使反应物溶解，依次用0.1 mol/L的氢氧化钠1 L洗涤3次，蒸馏水洗3次，蒸除溶剂，得红橙色浆状物。用硅胶柱层析，乙酸乙酯∶氯仿：石油醚(6：2：2)洗脱，合并相同组分，得2-氯-4-硝基苯-O-2,3,4-三乙酰-α-L-岩藻糖苷4.5 g，产率33.5%，熔点(144.6～146.6)℃，将2-氯-4-硝基苯-O-2,3,4-三乙酰-α-L-岩藻糖苷3.0 g溶于100 ml甲醇中，加入0.1 mol/L的甲醇钠30 ml，加热回流30分钟，蒸除溶剂，在甲醇中结晶，得CNPF 1.95 g，产率90.6%，熔点(71～73)℃。以上合成过程中的中间产物及终产物均经核磁共振图谱(NMR)、质谱(MS)、红外光谱(IR)、旋光及元素分析进行了确证。

二、试剂

PNPF、抗坏血酸、胆红素、人胎盘α-L-岩藻糖苷酶均购自Sigma公司，血红蛋白标准品源自卫生部临床检验中心血液室，其他化学试剂均为国产分析纯试剂。基质溶液：160 mg CNPF溶于100 mmol/L、pH 4.8的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液100 ml中。

三、仪器

HITACHI U3000分光光度计(带电子温控流动比色杯，能进行连续时间扫描)，HITACHI 7170全自动生化分析仪，Orion 520A型pH计，Mettler AE163(1/1×10⁵)、Satorius A 120S(1/1×10⁴)电子分析天平，Millipore Milli-Q plus超纯水系统。

四、方法

测定原理：1L血清中的AFU在37℃、pH 4.8下，1分钟内水解CNPF，每产生1 μmol/L CNP为1单位酶活性，简记U/L。

1. HITACHI U3000分光光度计基本参数：温度：37℃，灯转化方式：钨灯，狭缝：2 nm，吸样时间：2.0秒。

2. HITACHI 7170 全自动生化分析仪基本参数：温度：37℃，波长：405 nm，样本体积：25 μl，试剂体积：225 μl，测定方式：速率法，K因数：2 127，吸光度上限：25 000。

结果

1.反应监测波长的确立：对0.050 8 mmol/L的CNP在HITACHI U3000分光光度计上进行300～500 nm的波长扫描，可得到CNP的最大吸收波长为405 nm，将其作为反应的监测波长。

2.CNP的摩尔吸光系数: 对溶于pH 4.2～5.8、0.1mmol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中的0.051 mmol/L的CNP在HITACHI U3000分光光度计上进行了比色，所用波长为405 nm，得到CNP在不同pH处的摩尔吸光系数（图1），可见在pH 4.2～5.8范围内，随着pH的增加，CNP的摩尔吸光系数增大，也即随着pH的增加，同浓度的CNP在405 nm处的吸光度是逐渐增大的。

图1CNP在不同pH下的摩尔吸光系数

3.反应pH的确立：取100 μl样本，分别加入900 μl以柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 4.2～5.8)配制的5 mmol/L的CNPF，立即进行时间扫描，得到不同pH下的ΔA/分钟，再根据图1中相应的摩尔吸光系数算出酶活性，作出最佳呈色pH曲线和相应的反应最适pH曲线。结合两者，选择反应的pH为4.8，此pH下CNP的摩尔吸光系数为4 700 mol/L·cm^-1。

4.缓冲液浓度: 测定了100～400 mmol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 4.8)对酶活性的影响(图2)，发现随着缓冲液浓度的增加对酶活性有抑制作用，但考虑到缓冲液的缓冲容量，选择了100 mmol/L浓度的柠檬酸-磷酸氢二纳缓冲液作为测定AFU的缓冲条件。

图2缓冲液浓度对AFU酶活性的影响

5.底物浓度:以pH4.8柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(应用缓冲液)配制系列浓度底物液，对不同样本测定酶活性，以Linewear<