关键词： 显微镜检查；荧光；神经元；离子转运

【摘要】目的用普通荧光显微镜开发价廉实用、便于推广应用的细胞显微荧光自动检测系统。方法根据细胞荧光信息的生物学特点，综合运用现代光学、光电检测技术、微电子技术和计算机技术，在普通荧光显微镜上实现细胞荧光的快速、准确自动检测；根据生物学研究和临床要求，设计细胞显微荧光检测应用软件。结果在不破坏普通荧光显微镜结构的前提下，设计研制成全套细胞显微荧光自动检测系统。系统本底值在4～5小时内稳定性良好；对12个小鼠大脑皮层神经细胞测定得静息钙离子浓度为(148±92) nmol/L(±s)；高K⁺引起Ca²⁺信号立即增强，Glu灌流后Ca²⁺信号的变化也立即可以明显检测出来。结论本项研究工作适应细胞分析检测的现代化要求，价廉实用便于推广应用。

A practical system for automatic measurement of cellular microfluorescence

FAN Shifu, ZHANG Sixiang, XIAO Songshan, et al.

Department of Biomedical Engineering and Scientific Instrument, Tianjin University, Tianjin, 300072

【Abstract】ObjectiveTo develop a cheap, practical and convenient measuring system for cellular micro-fluorescence with popular fluorescent microscope.Method According to the biological characteristics of cellular fluorescence in formation with comprehensive use of modern optics, photo-electronic measuring technique, microelectronics and computer technique, a rapid, accurate automatic measuring system for cellular fluorescence based on popular fluorescent microscope was realized. In accordance with the requests of the biological research and clinical work, a series of application software have been designed.Results Based on nondestructiveness of popular fluorescent microscope, a whole system for automatic measurment of cellular microfluorescence was designed and developed. The baseline was stable in 4～5 hours; the value of intracellular resting［Ca²⁺］i in cultured mouse cerebral cortical cells was (148±92) nmol/L (±s), the kinetic changes of ［Ca²⁺］i induced by high K⁺ or glutamate were traced obviously and immediately.Conclusion The system is adequate to the modernization for cellular analysis in China. It is cheap, practical and convenient.

【Key words】Microscopy, fluorescenceNeuronsIon transport

近年来的文献报道和应用结果表明：细胞显微荧光光度分析已成为细胞研究和分析必不可少的手段。例如利用钙荧光指示剂测量细胞内游离钙离子浓度及其动态变化，是许多生理、病理过程研究以及诸如脑缺血、缺氧、帕金森氏病、早老性痴呆之类神经系统疾病防治的依据^［1，2］。

在流式细胞仪、显微图像分析仪、激光共聚焦显微镜、细胞扫描仪等大型仪器上可进行细胞显微荧光检测，但这些仪器不但依靠进口、价格昂贵，而且数量少、使用不便，只能为少量重点科研项目服务，不可能在临床诊断分析领域广泛推广。综合应用现代光学、光电检测技术和计算机技术的跨学科先进手段，对我国大量现有生物荧光显微镜进行改造，技术上升级换代、功能上大为拓展，实现方便可靠的细胞显微荧光光度自动检测，是我们按医学科技界的希望开展本项研究工作的目的。我们在不破坏普通荧光显微镜结构的前提下，完成了性能稳定、可靠、灵敏度高、重现性好的全套细胞显微荧光自动检测系统，已成功地应用于神经细胞内静息钙离子浓度的灵敏检测及细胞内静息钙离子浓度在高K⁺或谷氨酸盐的作用下的快速动态检测。使用结果证明：可以利用Fluo-3荧光反应检测单个神经细胞静息钙离子浓度，适用于跟踪静息钙离子浓度的动态变化（连续1小时内或更长些），也可以测定一团神经细胞的变化；对系统内的硬件或应用软件作适当改动，还可以扩展应用到其他细胞显微光谱分析或动态观测^［3，4］。

材料和方法

一、材料

1.显微镜：日本Olympus BH2-RFL型落射式荧光显微镜。

2.光电器件：日本滨松R446型光倍增管。

3.光源和滤光片：100w高压汞灯，该显微镜配套的激发滤光片和阻挡滤光片。

4.微机：486（兼容）PC机和打印机。

二、方法

1.不破坏显微镜结构，以光电倍增管检测头取代显微镜摄影头、直接插入显微镜筒。图1所示为本系统的检测原理框图。

图1显微荧光光度系统原理框图

2.设计适用的检测控制电路和信号处理电路(图2)。待测细胞荧光信号经PMT变换、输出的微电流经电流/电压变换—前置放大—低通滤波—主放大后变成标准信号，经A/D数据采集卡转换后输入计算机，PMT工作负高压监控、二阶切比雪夫低通滤波器和具有四级可选增益主放大器，保证了系统高信噪比、稳定和适应生物荧光检测的不同要求。

图2荧光光度信号处理及采集原理图

3.设计选区和电子快门结构。视场光阑孔径可调，在辅助照明光源作用下被成象于标本面上，从而可方便地选择1个细胞或细胞的一部分进行检测，还可阻挡非观测细胞的背景荧光。

4.设计中文Windows环境的工作软件，可完成数据采集、处理、绘图、计算及图形编辑、文件服务、在线帮助等功能，满足细胞荧光检测的各种要求。

结果

系统的应用研究结果如下。

1.系统线性度检测：用Hoechest33342(Sigma产品)染料对小白鼠精子和肝细胞染色体DNA含量相对检测结果如图3所示。取附睾及肝组织制成精子涂片及肝细胞印片后，滴染液后立即封片测定。染液用Hoechst33342 10 μmol/L，以弱紫外光激发，产生蓝白色荧光。每次检测前后测定无细胞本底值，每个细胞荧光量以减去平均本底的相对荧光量表示。反复测定证明，本系统在蓝绿光区（激发滤光片峰值波长360 nm，阻挡滤光片峰值455 nm）的线性度很好，而且精子荧光度和肝细胞荧光度的比例符合单倍体、二倍体、四倍体、八倍体的生物学特点。因此可作相对定量检测。

图3用Hoechst染色的白鼠精子

和肝细胞荧光值(相对DNA含量)检测结果

2.神经细胞内静息钙离子浓度检测：采用美国Molecular Probe公司的Fluo-3作Ca²⁺荧光探针（以10 μmol/L的Fluo-3/AM在37℃染色45分钟），以吸光度(A₄₉₀)激发光检测小白鼠大脑皮层细胞（培养于多聚赖氨酸处理的盖玻片上，在含10％小牛血清MEM液内，50％CO₂、37℃培养5～7天）。在A₅₃₀处发射的荧光强度，通过计算和标定可获得神经细胞内的静息钙离子浓度。图4是实测12个细胞的结果，扣除本底荧光值后平均值为14.2，标准偏差为3.05。

图4对神经细胞静息钙的测定结果

3.神经细胞内钙离子浓度的生理变化动态检测：神经细胞内比细胞外低四个数量级，某些化学物质可与特异受体结合而开放离子通道，使钙离子内流，使其浓度升高。图5所示，是采用单个神经细胞膜外液高钾或加入谷氨酸单钠盐，所记录下的细胞内钙离子浓度的动态变化曲线。细胞外液高钾时，钙信号迅速升高，停止后又很快恢复；加谷氨酸单钠盐，钙信号迅速升高，停用后则缓慢恢复。这个实验结果符合细胞生理学文献中公认的动态变化特点，也证明了本系统有足够高的时间分辨率。

图5神经细胞内Ca²⁺浓度的动态变化

3.系统长时间稳定性考核：多次实验证明，本荧光检测系统可在长达4～5小时的连续检测过程中稳定工作，不但一次实验中数据重复性好、而且长时间漂移不明显。所以适用于荧光变化动态检测。计算机系统可完成采样、记录、绘图、存盘、打印等功能。便于细胞显微荧光光度自动检测。

讨论

不破坏通用荧光显微镜结构、配<