聚合酶链反应(polymerase chain reaction，简称PCR)又称体外酶促基因扩增。它以敏感，特异，快速的核酸分析技术而著称，是分子生物学技术的一项突破。由Mullis发明于1983年。经不断的改进，现今已发展出了不对称PCR（aeymmetri′c PCR），反向PCR（inveree PCR），多重PCR（multipex PCR），锚定PCR（anchored PCR），差异显示PCR（olol PCR），定量PCR（quantity PCR）等多种PCR技术。

一、PCR的基本原理

PCR模拟于DNA的自然复制过程，引物按照碱基配对与DNA模板互补结合以后，在DNA多聚酶的作用下，按照碱基配对的原则（A、T，C、G），从引物开始合成与模板DNA互补的DNA链。经变性，退火，延伸等一次循环，DNA链数量增加一倍。

二、PCR步骤的要点

1.高温变性：双链DNA模板在热作用下（一般在95℃），使氢链断裂，双链解离，形成单链DNA这一过程称之为变性。变性后的单链可以重新结合，形成双链，其他性质也同时复原。

2.低温退火：模板DNA经过变性，分解为两条单链。经过系统温度降低，引物退火与互补的DNA模板结合，形成局部的双链，这也是DNA复制的起点。

3.中温延伸：引物与模板结合后，在DNA多聚酶的作用下，从引物的5′端向3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性，退火和延伸，DNA含量即增加一倍。

三、影响因素

PCR的结果在上述每一个步骤中，均会受一些因素的影响。如：

1.引物：C+G的核苷酸数应在45%～55％，以20个核苷酸为宜，如太短易出现错配，太长则易形成稳定的集合体。在一条引物内或一对引物间不应有5个以上的互补核苷酸。引物的浓度为0.1 μmol/L～1.0 μmol/L，就可完成30～35个循环的扩增，一般认为0.5 μmol/L已足够。过高浓度可能导致异位引导，可出现非靶序列的扩增。

2.PCR缓冲液：在反应体系中不能含有高浓度的鳌合剂（如EDTA），及负电荷离子基团（PO^-3₄）。Mg⁺²离子浓度要合适，它可影响引物的退火，模板和PCR中间产物的链解离，产物的特异性，引物二聚体的形成及酶活性等。Mg⁺²离子浓度也受DNA模板和鳌合剂的影响。

3.Taq酶：无论市售国产或进口的，都是当前质量较好的酶。应以1～2 U为宜，如加酶过量除浪费外，还有可能导致非靶序列扩增，太低又会影响PCR产量。但在经25～30次循环以后，酶含量便成为制约反应进行的因素。此时如仍需扩增，应以产物为模板，再行第二轮扩增为好。

4.靶序列：要以线性DNA作为模板最好。假如用质粒作反应模板，最好先将其线性化后再用。

5.退火温度：取决于反应体系中引物的浓度，引物长度及其核苷酸的组成，温度以比引物扩增的Tm值［（A+T）X²+（C+G）X⁴］低5°为宜。温度过低会增加引物与模板之间的错配现象，特异性就会下降。

6.延伸时间和温度：Taq酶的酶活性温度可在20℃～85℃之间。但温度太低会引起非特异性扩增现象的增加，太高则会引起引物与DNA之间的变性，因此一般选用72℃。延伸时间取决于所扩增片段的长度，片段长者时间要长，短者则要短。但在最后一次循环的延伸，为使所有的产物完整，时间可以更长。

7.循环次数：亦取决于模板的浓度。模板浓度高者，循环次数少，低者循环次数可增加。一般循环30～35次足够。此时所得产物生成速度已经接近平台期，再增加循环次数不但不能增加产量，反而引起非特异性背景产量的增加，循环次数太少则产量就降低。

四、PCR的用途

PCR可应用于各生物学领域：

(1)扩增各种蛋白的基因：可用于基因重组、蛋白表达、构建cDNA文库，目前所用的基因工程生物产品，绝大多数为通过PCR方法而获得的目的基因。(2)PCR后的测序：可以很快地测出常规的PCR产物或单链的DNA序列。(3)用于分子进化和种系发育的研究，因为在一些巨大分子的序列中含有足够的进化信息，通过PCR对其编码基因的扩增，并与较近或较远的种系比较，研究其分子进化及种系发育是很有用的。(4)分析和诊断遗传性疾病，根据其基因的缺失或突变对其做出诊断。如甲型血友病、苯丙酮酸尿症、地中海贫血等有特定的遗传性基因，可以做出明确的诊断。(5)对人类HLA基因的多肽性分析，用于器官移植的配型。比原有的免疫学方法要好得多，无论在准确性及特异性，检测的速度等方面都提高了许多。(6)对于某些基因突变，如肿瘤发生的研究等均很有用。

五、在感染性疾病中的应用

由于种种原因，许多传染性疾病要进行病原学诊断，如病毒、微生物、支原体等感染人体后复制的量少或检测方法需等待1个月以上才出结果，不能及时诊断。但一定要指出，能采用血清学方法诊断的病原体感染，一般不再用PCR。

对病原体进行基因分型和同源性比较，必须采用PCR，研究病原体的地区分布、基因变异，指导临床治疗。要研究克隆病原体各种蛋白基因，用于蛋白表达，纯化后制备血清学诊断试剂原材料。当发现新的病原体，如丙肝病毒(HCV)、庚肝病毒(HGV)和TT病毒(TTV)亦均为用分子生物学方法才发现的新病原体，即用随机PCR扩增，将扩增产物的序列与其他已知病原的序列比较而被发现。

六、在诊断病原体感染时的优缺点

1.优点：(1)灵敏度高。理论上，只要标本中含一个分子DNA或RNA就可做出诊断，因为有模板就可扩增。(2)特异性强。对于一个20核苷酸引物来说，非特异性配对的概率为4。可以克服血清学诊断造成交叉反应的缺陷。(3)早期诊断。如对HCV感染，第1周即可检测出HCV RNA，而检出抗体一般均要在感染的第2周以后。(4)对有些体液免疫力低下或使用免疫抑制剂时无抗体产生者，PCR可检出明确的病原，最后可确诊。(5)一般病原体检测，用EIA法只能做出阳性判断，定量则不行。PCR可以对病原体做定量分析，这样可以反映出病原体在机体内复制及动力学变化情况，得到药物治疗效果的准确信息。(6)可对病原体做基因分析，指导临床诊断及治疗。

2.不足之处：(1)操作复杂，需熟识分子生物学基础知识及熟练操作技能的技术人员去掌握。(2)价格相对昂贵。(3)由于敏感性太高，操作步骤多而复杂，极少量的污染，如气溶胶也会造成假阳性。(4)因操作复杂，对试剂及实验条件要求严格，稍有差错就会出现假阴性。

七、对假阳性或假阴性的预防对策

1.对于假阳性的预防对策：假阳性几乎均由污染所致，有产物的污染，交叉污染，重组质粒，培养物以及其他的污染。对产物污染的预防：(1)在操作PCR的实验室内要采用至少一种针对产物污染的方法。(2)尿苷酶（UNG）消解，是在前PCR消解，其方法为在扩增中以脱氧尿苷（dUTP）取代脱氧胸苷（dTTP），使含尿苷产物被尿苷酶消解，再经加热或碱处理，这样即在脱氧尿苷处断裂，不再能作为模板扩增，可能的产物污染即被消除。(3)补骨脂素加合，是在后PCR加入，即PCR反应体系中加入补骨脂素，扩增后以紫外线照射反应体系，补骨脂素加合到核酸上，使加合了补骨脂素的DNA不能再作为模板，但仍能用于杂交。(4)3′端一次黄苷引物：是后PCR，即在引物合成时其3′端引入黄苷，PCR之后加入氢氧化钠，热处理后，含引物的序列即被破坏。

对于交叉污染的预防对策：如培养物及其他污染的预防，应采用综合性防范措施：(1)要求实验人员岗前培训及定期考核，(2)实验设备及试剂的规范化和标准化，(3)设严格阴性质控，(4)器械要专用，(5)消耗品一次性专用，(6)严格规范的操作程序。

对出现污染现象后的措施：(1)发现污染必须重新检测，对产物污染所致的假阳性最好使用抗污染的检测方法。(2)试剂污染后，则必更换试剂。(3)清洁工作环境、器械和仪器等。(4)查找污染源。

2.对于假阴性的预防对策：假阴性可由操作不当、试剂质量差或过期、仪器设备不准确等因素引起。采取的措施是：(1)上岗人员的岗前规范化的培训，考试合格后持证上岗操作。(2)实验中设严格的质控。(3)严格按试剂生产厂家提供的实验程序操作，不能任意更改。(4)一律使用质量认定过的试剂，不得过期。(5)改用病原体其他区段的引物再试，特别在有基因变异者。(6)经常检查仪器的设置是否符合要求，如温度、时间、循环次数及器械量的准确度。

八、设备及试剂的规范化和标准化

1.实验设备的规范化：PCR实验室应有3个区：试剂准备区（一区）、标本准备区（二区）、扩增与检测区（三区）。各区有完善的相应设备，并一定遵循从一到二到三区单方向工作，并要互相隔开，以免互相污染。还要注意：(1)各区的物品严格分开，不能串用。(2)各区应有完善的清洁及消毒措施，并定期清洁及消毒。(3)实验仪器要准确，如PCR循环仪的实际温度与设定温度之差不应该超过±1℃，取样器刻度精确。

2.实验试剂的标准化：采用经国家鉴定合格，并有批准生产文号的优质试剂。严格按照详细的操作说明及注意事项来操作，设立多个强阳性、弱阳性及阴性对照。说明书的内容应包括产品名称、批号、批准文号、生产厂家名称、试剂保证条件、有效期和出厂日期及检验合格证等。

3.对操作人员的要求：(1)具有较高的专业素<