利福平（RFP）耐药性的产生系由于结核分枝杆菌(结核菌)编码RNA聚合酶β亚基（rpoB）的基因突变所致^［1］。目前检测rpoB基因突变的聚合酶链反应（PCR）方法，所用引物大多对结核菌特异性较差，其他分枝杆菌也能获得扩增。我们结合国外研究资料，采用3条针对结核菌的特异性引物，进行单管半套式PCR扩增，并应用单链构象多态性（SSCP）法检测rpoB基因突变，从分子水平探讨结核菌RFP耐药和rpoB基因突变的关系。

一、材料与方法

1.菌种、菌株来源：结核菌H₃₇R_V标准株、15株分枝杆菌和8株富含GC细菌来源于中国药品生物制品鉴定所。55株结核菌临床分离株由河北省胸科医院及本院细菌室提供，按常规进行药敏试验，其中RFP敏感株15株，RFP耐药株40株。

2.DNA提取：采用经典酶解法。

3.单管半套式PCR：（1）引物：根据结核菌rpoB基因序列^［2］设计3条引物，R₁5′-CGTGGAGGCGATCACACCGCAGAC-GT-3′，R₂5′-AGTGCGACGGGTGCACGTC-GCGGACCT-3′，R₃5′-GACCTCCAGCCCGGCACGCTCACGT-3′，最终扩增产物为一193 bp片段，该片段包括了易发生RFP耐药突变的69 bp范围，并具有唯一针对结核菌的特异性^［3］。（2）单管半套式PCR^［4］：采用一个Eppendorf管、两步法PCR。

4.SSCP分析：取10 μl第2轮PCR扩增产物加入等体积甲酰胺变性液（98%甲酰胺，10 mmol/L EDTA，0.025%溴酚蓝，0.025% 二甲苯腈）混匀，95℃变性10分钟，冰浴骤冷，立即上样于预电泳30分钟的6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，6℃，200V电泳3～4小时，EB或银染色后观察结果并照相。

二、结果

1.结核菌rpoB耐药基因引物PCR扩增的特异性：应用R₁、R₂引物进行第一轮PCR后均未扩增出DNA条带，而用R₁、R₃引物进行第二轮PCR后，H₃₇R_V和55株结核菌均扩增出一条193 bp DNA条带，而15株其他分枝杆菌和8株富含GC细菌均未扩增出193 bp DNA条带，其特异性为100%。

2.结核菌rpoB耐药基因PCR扩增的敏感性：纯化的H₃₇R_V染色体DNA经751分光光度计定量后，用双蒸水按10倍系列稀释至0.1 fg/μl，取1 μl进行单管半套式PCR扩增后，取5 μl扩增产物行2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后观察其敏感度约为10 pgDNA，即有10个左右细菌便可检出。

3.结核菌临床分离株SSCP检测结果：结核菌临床分离株SSCP分析以标准株H₃₇R_V为对照，15株RFP敏感株的SSCP迁移率与H₃₇R_V相同，而34株RFP耐药株与H₃₇R_V的SSCP迁移率不同，其阳性率为85%（34/40株）。

三、讨论

RpoB基因是一种高度保守序列，除结核菌外，它还广泛存在于其他分枝杆菌和富含GC碱基的各类细菌。Hunt等^［3］通过对分枝杆菌和富含GC细菌基因扩增产物的DNA序列分析，发现在其共有的高度保守序列之外，由6个核苷酸组成的5种特异性序列，其结合产物仅出现于结核菌。根据上述研究结果，我们应用3条针对结核菌的特异性引物进行单管半套式PCR，避开了包括结核菌在内的各种分枝杆菌以及富含GC的各类细菌所共有的高度保守序列，获得了唯一针对结核菌的特异性，克服了大多PCR对检测结核菌特异性不高的缺点。本研究经两轮PCR扩增后，唯结核菌扩增出一条193bp的DNA片段，而其他15种分枝杆菌和8种富含GC细菌均未得到扩增，表明它是一种特异性较高的检测结核菌的PCR方法。此方法只需1个Ependorf管，减少了试验中的污染机会，其敏感性达10pg DNA，相当于10个左右结核菌。

现已明确RFP是通过与rpoB基因编码的RNA聚合酶β亚基结合，干扰转录启动和RNA延伸而发挥其抗结核作用的，若rpoB基因突变，其构象发生变化，阻止了RFP结合，即导致对RFP耐药。这使我们通过简便的PCR-SSCP即可检测结核菌有无rpoB基因突变。我们应用单管半套式PCR-SSCP分析了15株RFP敏感株和40株RFP耐药株结核菌，结果15株RFP敏感株SSCP图谱与参考株H₃₇R_V一致，即遗传标志rpoB基因未发生突变；而40株RFP耐药株中，34株SSCP图谱与H₃₇R_V有差异，即ropB基因发生了突变，其发生率为85%，与文献报道相仿^［3，4］。

总之，本研究证明了单管半套式PCR是一种检测结核菌的简便、敏感、特异的方法，同时结合SSCP技术测定结核菌rpoB基因突变，对判断RFP耐药、研究RFP耐药机理及指导临床合理用药具有一定实用价值。

参考文献

1Morris S, Bai GH, Suffys P, et al. Molecular mechanisms of multiple drug resistance in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis.J Infect Dis,1995, 171:954-960.

2Miller LP, Crawford JT, Shinnick TM. The rpoB gene of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother, 1994,38:805-811.

3Hunt JM,Roberts GD,Stockman L,et al. Detection of a genetic locus encoding resistance to rifampin in mycobacterial cultures and in clinical specimens.Diagn Microbiol Infect Dis, 1994,18:219-277.

4Whelen AC, Felmlee TA, Hunt JM,et al. Direct genotypic detection of mycobacterium tuberculosis rifampin resistance in clinical specimens by using single-tube heminested PCR. J Clin Microbiol,1995,33:556.

(收稿：1998-10-09修回：1999-01-21)