耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)不仅对β-内酰胺类抗生素耐药，还对氨基糖甙类等多种抗生素耐药，是现有抗生素难以控制的医院感染菌^［1］。寻找适合医院临床实验室检测MRS的简易、精确的方法，是控制MRS感染的关键。我们对临床分离的100株葡萄球菌用聚合酶链反应(PCR)扩增耐甲氧西林的基因mecA，按美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的琼脂筛选法、浓度梯度法(Etest法)、纸片扩散法检测其耐甲氧西林特性和比较，报告如下。

一、材料和方法

1.菌株：瑞金医院检验科临床标本分离葡萄球菌100株，标准参考株ATCC25923。

2.试剂：(1)苯唑西林(1 μg/ml)药敏纸片；(2)Etest苯唑西林纸条AB BIODISK产品；(3)mecA基因扩增引物，引物1：5′-AGATTGGGATCATAGCGTCA-3′(374～394 nt)；引物2：5′-GAAGGTATC-ATCTTGTACCC-3′(632～652 nt)、Taq聚合酶、dNTPs、Mg²⁺，系上海生工工程公司产品。

3.培养基：MH培养基为BBL公司产品。

4.菌种鉴定：凝固酶试验初筛，API-Staph系统试条鉴定。

5.MRS琼脂筛选法、Etest法、纸片扩散法，按NCCLS标准^［2］进行。

6.mecA PCR检测：反应体系50 μl，内含10×缓冲液5 μl、Taq酶1U、dNTPs各200 μmol、Mg²⁺1.5 mmol、引物各10 pmol/L、模板DNA 1 μl。94℃预变性3分钟，94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，70℃延伸1分钟，35个循环后延伸5分钟。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳EB染色，278 bp处出现荧光条带为阳性。同时以甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性的葡萄球菌、肠球菌和大肠埃希菌提取的DNA为模板，同法扩增后电泳，做特异性检测。

二、结果

金黄色葡萄球菌(SA)mecA阳性26株(26/44)，阳性率59.1%，其最低抑菌浓度(MIC)都大于4 μg/ml；凝固酶阴性葡萄球菌(CNA)mecA阳性43株(43/56)，阳性率76.2%，41株MIC＞4 μg/ml。mecA阳性葡萄球菌其琼脂筛选法均表现耐药。琼脂筛选法共检出耐药株73株(73/100)，其中有4株mecA阴性，而MIC＞4 μg/ml。mecA阴性的18株的SA中，16株MIC≤2 μg/ml；mecA阴性的13株CNS，10株MIC≤2 μg/ml。

三、讨论

我们使用的表型检测法中培养基均加入2%～4%NaCl，孵育温度35℃，mecA阳性的69株葡萄球菌琼脂筛选法均显示耐药，提示在上述条件下mecA基因可得到较好的表达。琼脂筛选试验的结果和其他几种耐药检测法有较好的相关性，且琼脂筛选法操作方便、设备简易，是检测MRS值得推荐的方法。4株mecA阴性的葡萄球菌纸片扩散法和琼脂筛选法均表现耐药，且MIC≥4 μg/ml，提示仅以PCR扩增mecA的阳性结果作为判断MRS的唯一标准，可能会造成漏检，以致不能正确指导临床用药。

参考文献

1马纪平，苏建荣，靳景图.耐甲氧西林青霉素葡萄球菌.中华医学检验杂志，1996，19：186-188.

2Shlmaoka M, Yoh M, Segawa A, et al. Depelopment of enzyme-labeled oligonucleotide probe for detection of mecA gene in Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. J Clin Microbil, 1994, 32: 1866-1869.

(收稿：1998-11-11修回：1999-03-24)