关键词： 肝炎病毒；乙型；聚合酶链反应；色谱法；凝胶

【摘要】目的建立聚合酶链反应(PCR)-凝胶呈像(gel documentation systems, GDS) 技术，并应用于临床检测乙型肝炎病毒（HBV）核酸DNA。方法用凝胶呈像技术对血清HBV-DNA PCR 扩增产物的电泳凝胶进行摄像、分析，并与紫外灯下的肉眼观察结果相比较，对肉眼未判断出阳性而凝胶呈像分析出阳性的血清标本，用定量PCR(QPCR)方法检测HBV-DNA。结果通过38份血清标本的检测，发现用凝胶呈像技术判断的结果比单纯肉眼观察的阳性率高。前者19份阳性（50%），后者16份阳性（42.1%），符合率为92.1%。经χ²检验（χ²=0.477，P＞0.05），说明两种方法有很好的一致性。凝胶呈像分析为阳性，而肉眼观察阴性的3份血清标本，经定量PCR检测为阳性。结论应用凝胶呈像技术比PCR产物电泳后紫外灯下肉眼观察的灵敏度高、客观性强，能避免与紫外线接触，并可长期保留检测结果。

Application of gel documentation systems in HBV detection with PCR

ZHENG Zhihong, ZHANG Liwei, SUN Rui, et al.

Sixth People′s Hospital, ShenYang 110006

【Abstract】ObjectiveTo establish polymerase chain reaction-gel documentation system (PCR-GDS) technology for detecting deoxyribonucleic acid of hepatities B virus (HBV-DNA) in sera.Methods The electrophoresis gel with HBV-PCR amplification products was analysed with GDS and observed with naked eyes in ultraviolet. Quantity PCR(QPCR) was employed in the sera whose PCR product was negative in naked eyes observation but positive in GDS analysis.Results In 38 sera samples of patients, the positive rate by GDS was higher than that by naked eyes ［50% (19/38) and 42.1% (16/38)］. The corresponding rate of the two tests was 92.1% (χ²=0.477, P＞0.05). A good coherence was noted between the two methods. Three sera samples positive by GDS and negative by naked eyes were detected positive with QPCR.Conclusion With higher sensitivity and objectivity, GDS avoids the exposure of observers to ultraviolet and preserves the data for a long time.

【Key words】Hepatitis B virusPolymerase chain reactionChromatography, gel

在国内外，聚合酶链反应（PCR）技术已被公认为检测各种病原体的最佳手段^［1］。针对普通PCR结果的判断需要在紫外灯下观察荧光条带，受主观因素的影响；观察人员长期受紫外光照射，对身体有害等缺陷，我们采用凝胶呈像技术对普通PCR电泳检测乙型肝炎(乙肝)病毒（HBV）核酸DNA的结果进行摄像、分析，通过电脑软件能够将电泳条带准确地标出其位置和峰值，有利于阳性结果的客观判断，而且还可以进行半定量分析。

材料和方法

一、标本

沈阳市传染病医院PCR室提供的血清38份。

二、试剂

HBV-DNA PCR试剂盒，由厦门达海科技有限公司生产（批号：101980330）。HBV-DNA定量PCR诊断试剂盒，为美国Acu Gen公司生产（批号：20-1000-70）。

三、仪器

1.凝胶呈像仪：美国紫外产品有限公司生产，GDS-8000型。

2.定量PCR仪：美国Acu Gen公司生产，扩增仪：FGEND2TD型，分析仪：AG-9600型。

四、方法

1.血清HBV-DNA定性PCR检测，按HBV-DNA PCR诊断试剂盒说明书进行，扩增HBV-DNA前C-C区的568个碱基片段，将电泳结果在紫外透射仪上照相。

2.电泳后凝胶置于GDS暗箱中摄像，图片输入电脑后，利用一维凝胶工作软件对图像进行分析、检测，判断扩增条带的位置及峰值。结果判断标准：与阳性标准条带位置相同的峰值为有意义的条带，其他位置显示的峰值为非特异性扩增条带。

3.定量PCR检测^［2］：(1)标本处理：采用二氧化硅吸附法，提取DNA模板；(2)不对称扩增及荧光引物参与的扩增均按试剂盒操作说明书进行；(3)用荧光检测仪对各个反应体系的荧光强度进行定量检测，通过ASAP软件，根据实验中设定的阴阳性对照，最大信号对照，及5个含不同数量级的HBV阳性标准对照的荧光强度变化，计算出样品HBV-DNA含量。

结果

1.38份血清标本进行定性PCR检测，将电泳凝胶在紫外透射仪上直接观察，16份阳性，占42.5%。凝胶呈像分析19份阳性，占50%，二者符合率为92.1%。经χ²检验，χ²=0.477，P＞0.05，说明二者有很好的一致性。凝胶呈像分析图片中，对肉眼难以辨别的条带，电脑软件能做出客观的判断（图1）。

1：阳性对照，2：阴性对照，3～40：样品；带有棱形亮标的为阳性

图1凝胶呈像仪分析处理后的HBV DNA定性PCR凝胶图片

2.图中，4、7、32号标本为肉眼观察阴性、凝胶呈像分析阳性的标本，经定量PCR检测均为阳性，分别为4.68×10²拷贝/微升、4.50×10²拷贝/微升和2.96×10³拷贝/微升。

3.凝胶呈像分析结果曲线图（图2）：阳性标本在特定位置出现峰值（均在4 mm处），如6号和9号标本；而阴性标本无峰值出现，如2号标本。图中横坐标代表荧光带的位置，纵坐标代表荧光强度，间接反应核酸含量。

图22、6、9号标本凝胶呈像分析曲线图

讨论

HBV感染的诊断主要依赖于血清特异性抗原抗体和HBV-DNA的检测。PCR是检测HBV血症最敏感的方法。应用PCR技术发现，30%～40%HBV表面抗原（HBsAg）阴性，所谓隐原性肝硬化、非甲非乙慢性肝炎患者仍为慢性HBV感染^［3］。虽然近年来有人主张用核酸杂交法检测HBV^［4］，但核酸杂交操作繁琐，不及PCR方法敏感。对微量HBV-DNA的检测还需依赖于定性或定量PCR的测定。定量PCR能够对血清中HBV-DNA进行定量，灵敏性高，但价格昂贵操作复杂。我们采用的凝胶呈像技术对普通PCR电泳结果进行分析、处理，肉眼观察的阳性结果与软件分析的阳性结果有很好的一致性。肉眼未观察到阳性，而软件分析出阳性的标本，用定量PCR方法检测，证实为阳性。说明凝胶呈像技术能使普通PCR电泳结果的敏感性增高，减少主观因素造成的影响；而且操作者不与紫外线接触，操作方便；检测结果可以打印或储存于计算机内，以便保留查阅，且其保留结果的直观性是其他任何一种检测方式也难以替代的。凝胶呈像软件系统还可以根据荧光带的强弱给出带的峰值，依据峰值高低可以间接判断含量。只要保证每个样品前后操作一致，峰值的高低与扩增后样品的核酸含量应成正比，与血清中HBV DNA含量呈正相关。利用凝胶呈像技术可以排除非特异性扩增。曲线横坐标上所显示的峰的位置，相当于迁移率。只有位置相同的峰，才为特异性峰值。不仅如此，凝胶呈像技术还具有计算迁移率、分子量、核酸含量等多种功能。

在微量HBV-DNA检测上，PCR有其实用价值。由于HBV基因变异的存在，出现表达产物与核酸检测的不同步现象，如出现无血清学标志物而HBV-DNA检测阳性情况，只能依靠PCR方法检测其HBV-DNA^［5］。在乙肝的干扰素治疗上，作为抗病毒疗效的评价也有其重要作用。乙肝患者在干扰素治疗后复发的原因，是肝组织中仍残留微量的HBV-DNA，而Southern印迹杂交法测定的敏感度(检测低限可达0.1 pg)是不足以检出的，因而认为干扰素治疗慢性乙肝的疗效应用PCR作为评估方法^［6］。在血液及血制品检测及献血员筛选中，PCR的灵敏性都充分发挥了其重要作用。定量PCR试剂价格昂贵，尚难以普及使用。凝胶呈像技术与普通PCR相结合，可以使普通PCR检测方法更敏感，而且还可以进行半定量操作，具有广泛的应用前景。

参考文献

1杨振.PCR技术应用于HBV检测的研究进展.微生物免疫学进展，1995,23：231-234.

2杨复春，吴婉芬，董惠卿，等.定量聚合酶链反应检测血清中HBV-DNA及其临床应用.中华传染病杂志， 1997， 15，1：24-27.

3Zhang YY, Hansem BG, Guo LS, et al. Hepatitis B virus DNA in Chinese patients with chonic liver diseases okespite the presence of antibodies to HBsAg. Hepatology, 1993, 17： 538-544.

4顾长海.乙型肝炎的过去、现在和将来.见：骆抗先，编著.乙型肝炎的基础和临床.北京：北京人民卫生出版社， 1997.1-6.

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