关键词： RNA；信使；RNA聚合酶类；细胞核

【摘要】目的在转录水平上分析某种信号引起细胞特定基因表达改变的量效关系。方法采用SKO₀₀₇细胞，逐一对无损细胞核的制备、新生转录反应和［α-³²P］标记新生mRNA的提取等关键步骤进行了方法学研究，并对我室研究白细胞介素(IL)-6信号转导机制的常用细胞系IL-6、IL-6受体(R)α、IL-6Rβ的表达进行了鉴定。结果1×10⁵细胞即可得到阳性杂交信号，细胞数在5×10⁵～1×10⁷范围内，其杂交信号随细胞数的增加而增强，线性及重复性满意。常用细胞系除Molt₄外，均有不同程度的IL-6、IL-6Rα和IL-6Rβ表达。结论所建立的方法在受试细胞数仅为国外报道的十分之一时即可完成操作，且操作相对简单，易为人们接受。

The nuclear runoff transcription assay and its initial applicationWU Lijuan^*, LI Yan, NI Changyuan, et al. ^*Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042

【Abstract】ObjectiveTo establish nuclear runoff transcrption assay (NRTA) which may analyse specific gene expression of some cell lines in trancription levels aroused by the signal, so we can use NRTA in researching the role of IL-6 in multiple myeloma.MethodBy SKO₀₀₇ cells, technical parameters of NRTA during intact nuclei preparation, nuclear runoff transcription reaction, ［α-³²P］ mRNA purity, etc were studied. We established an improved newly NRTA and determined IL-6, IL-6R_α and IL-6R_β mRNA levels of some cell lines for researching signal transduction of IL-6.Results1×10⁵ cells were able to gain a positive hybridizational signal which is distinguishable. Hybridizational signals increased when cell quantity increased from 5×10⁵ to 1×10⁷. Its linear and repeativity were good. Five cell lines except Molt₄ exprese IL-6, IL-6R_α, IL-6R_β.ConclutionThe required cell quantity for test of the NRTA is only one tenth of reported openly. It is simple and easy.

【Key words】RNA, messengerRNA polymerasesCell nucleus

新生mRNA分析技术(nuclear runoff transcription assay，简称NRTA)，是当前分析细胞功能特异性基因转录的最灵敏方法。我们在总结当前国外有关报道的前提下，对NRTA某些重要操作步骤进行了调整和改进，并对我室研究白细胞介素6(IL-6)信号转导系统常用的几株细胞系进行了IL-6、IL-6受体(R)α、IL-6R_βmRNA水平的鉴定。

材料和方法

一、细胞系及培养

将人多发性骨髓瘤细胞系SKO₀₀₇(ATCC购置)悬浮在含10%灭活小牛血清(FCS)的RPMI-1640培养体系中，置37℃，5% CO₂条件下培养，每2～3天换液传代1次。试验前，收集细胞，用无血清RPMI-1640培养液洗涤细胞2次，在2%FCS RPMI-1640培养液中放置4～5小时，转入10%FCS RPMI-1640培养液培养48小时。人Burkitt淋巴瘤细胞系Raji(英国帝国肿瘤基金会惠赠)、急性淋 巴细胞白血病细胞系Motl₄(英国帝国肿瘤基金会惠赠)，培养方法同SKO₀₀₇细胞。鼠杂交瘤细胞系7TD₁(购置自ATCC)培养方法同上，培养液中另加有终浓度为5 μg/L的IL-6和5×10^-5 mol/L的2-巯基乙醇。粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)依赖细胞系TF₁(引自中国预防医学科学院病毒研究所)，培养方法同SKO₀₀₇细胞，培养液中补有终浓度为50 μg/L的GM-CSF。

二、NRTA

1.cDNA硝酸纤维素膜条的制备：用PCR法克隆IL-6、IL-6R_α和IL-6R_β特异性cDNA片段(长度分别为500、520和600 bp)，经纯化后每孔100 ng固定在硝酸纤维素膜(Promega产品)上。临用前剪成小条。

2.细胞核制备：(1) NP-40裂解法：参照文献^［1-3］略有改进。将收获的SKO₀₀₇细胞(5×10⁶)用磷酸盐缓冲液(PBS)洗1次，加入预冷NP-40裂解液1.0 ml，温和混匀冰浴10分钟，在4 ℃离心5分钟，吸弃上清液。再用PBS洗1次，加入100 μl预冷甘油缓冲液，吹吸混匀，-70 ℃存放备用。(2) 蔗糖梯度超速离心法^［1-4］：细胞用量5×10⁶。(3) 低渗缓冲液裂解法^［5］：细胞用量5×10⁶。(4) 改良NP-40裂解法^［6］：细胞用量5×10⁶。

3.新生转录反应：室温解冻细胞核，立即加入100 μl 2×反应缓冲液^［3］和100 μCi［α-³²P］UTP，25 ℃水浴振摇60分钟。

4.新生mRNA的提取：见参考文献［6］。

5.RNA和cDNA的杂交与检测：参照文献［4］进行。压片后-70 ℃曝光4～5天，放射自显影后，激光扫描仪扫描测相对杂交信号强度。

三、方法学试验与评价

采用SKO₀₀₇细胞对NRTA各重要步骤的试验参数进行研究，并对方法的灵敏度、重复性和线性进行评价。

四、初步应用

采用所建立的NRTA方法对我室研究IL-6信号转导机制常用的几株细胞系(SKO₀₀₇、7TD₁、TF₁、Molt₄和Raji)进行了IL-6、IL-6R_α、IL-6R_β表达水平的鉴定。

结果

一、方法学试验与评价

1.cDNA用量：图1提示cDNA最适用量为100 ng/孔(图1)。

图1硝酸纤维素膜条cDNA印迹用量

2.［α-³²P］UTP用量：图2提示［α-³²P］UTP用量应在50 μCi以上，以100 μCi为好(图2)。

图2新生转录反应［³²P］UTP用量曲线

3.新生转录反应温度：图3提示25 ℃杂交信号最强(图3)。

图3新生转录反应温度的选择试验

4.新生转录反应时间：图4提示最佳转录时间应为60分钟(图4)。

图4新生转录反应的时间曲线

5.杂交时间：图5提示最适杂交时间为36小时(图5)。

图5杂交反应时间的选择系较好。

6. 4种核制备方法的比较：采用前述4种方法分别提取SKO₀₀₇细胞核涂片，做瑞氏染色和新生mRNA分析，NP-40法制备的核，细胞质成分去除完全，体积无明显改变，核膜完整，核仁结构清晰，经NRTA所得杂交信号最强。7.灵敏度试验：1×10⁵即可出现肉眼可辨的阳性杂交信号。5×10⁵以上的细胞阳性杂交信号十分明确。

8.重复性试验：将同批收获的细胞等分成10份，每份5×10⁶，试验所得杂交信号经扫描分析，强度为(10.00±1.12)%，CV值0.11。

9.线性范围：结果提示在5×10⁵～1×10⁷范围内随着受试细胞数量的增加杂交信号加强，线性关二、初步应用结果

IL-6 mRNA的表达：SKO₀₀₇＞7TD₁/TF₁＞Raji；IL-6RαmRNA的表达：SKO₀₀₇＞7TD₁＞TF₁＞Raji；IL-6R_β的表达：SKO₀₀₇＞7TD₁＞TF₁＞Raji。Mot14则不表达IL-6、IL-6R_α和IL-6R_β。

讨论

NRTA技术是细胞核内新生mRNA的专用分析技术，它能测定细胞核内特定基因在某一时刻的转录水平，从而区别于逆转录(RT)-PCR、Northern印迹等这类只是对基因转录产物累积性相对水平进行分析的方法。实验时，冰浴收集某一“瞬时”的细胞核，加入含NTPs(至少有一种经同位素标记)的缓冲液，依赖核内原有的转录酶促系统，将核分离瞬时暂停的转录继