关键词： 多态现象；单链构象；受体；胰岛素；突变；聚合酶链反应

【摘要】目的建立聚合酶链反应单链构象多态性（RCR-SSCP)和银染技术筛查胰岛素受体基因突变方法。方法选择89例非胰岛素依赖型糖尿病患者，PCR扩增编码胰岛素受体酪氨酸激酶域的外显子（外显子17～21），进行SSCP电泳，银染色后，对突变样品进行序列分析。结果发现11例外显子17和1例外显子20的异常电泳条带，外显子17的突变经顺序分析，为CAC¹⁰⁵⁸→CAT¹⁰⁵⁸的杂合和纯合多态性突变。结论PCR-SSCP结合银染技术是一种操作简便、经济、灵敏度高、适合于临床大样本基因突变筛查的方法。

PCR-SSCP and silver staining technique in screening insulin receptor gene mutation NIU Wenyan, SHI Jiandang, ZHANG Wei， et al.Tianjin Medical University, Tianjin 300070

【Abstract】ObjectiveTo establish polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism(PCR-SSCP) and silver staining technique to screen mutation of insulin receptor gene.Methods89 patients with NIDDM were collected.Exon 17-21 of insulin receptor gene were amplified by PCR and screened by SSCP electrophoresis.After silver staining,the mutation samples was sequenced.ResuletsEleven variant sequences in exon 17 and 1 in exon 20 were detected. Direct sequence analysis of exon 17 showed that homozygous and heterozygous nonsense mutations were silent polymorphism at position 1058 (CAC→CAT).ConclusionThe PCR-SSCP combining with silver staining technique is simple, economic, and sensitive.

【Key words】Polymorphism, single-stranded conformationalReceptors, insulinMutationPolymerase chain reaction

1989年Orita等建立的单链构象多态性技术具有简便、灵敏度高等优点，结合非同位素的银染具有灵敏度高、操作简便等优点，受到研究者的青睐。Ⅱ型糖尿病是由多种基因参与致病的代谢性疾病，为探讨胰岛素受体（INS-R）基因在其中所起的作用，我们用PCR-SSCP方法对89例非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)患者INS-R基因进行了突变筛查。

材料和方法

一、材料

蛋白酶K(德国MERCK公司产品），PCR试剂(Promega公司产品)，丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺(为美国Bio-Rad公司产品)。

研究对象：89例非严重胰岛素抵抗的普通NIDDM患者，选自天津医科大学总医院内分泌科(NIDDM按WHO 1985年诊断标准)。正常对照者无慢性疾病，口服葡萄糖耐量试验(OGTT)正常，血清胰岛素正常，HbA1c＜6.1%，血压正常。

二、方法

1.合成寡核苷酸引物：参照Seino等^［1］的引物设计。

2.提取外周血DNA：取抗凝外周血3 ml，分离白细胞，应用苯酚-氯仿方法提取DNA，使纯度达到A260/A280，大于1.8。

3.PCR扩增目的基因片段：扩增体系50 μl，用2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

4.SSCP分析：聚丙烯酰胺凝胶浓度为6%～12%，交联度为49∶1，取5 μl PCR产物，加等体积的甲酰胺变性液，98℃变性5分钟后置冰浴，在电压100～300V，温度4℃或20℃条件下，电泳5～20小时（依据不同的外显子采取不同的电泳条件）。

5.银染：电泳结束后，用乙酸固定，纯水洗，银染液染色（1.4g/L AgNO₃和甲醛），纯水洗，加显色液（30g/L Na₂CO₃，甲醛，400 μg/L Na₂S₂O₃)显色，乙酸终止反应，用玻璃纸封好胶片，晾干后长期保存。

6.测序：将SSCP检出的样品用低熔点琼脂糖凝胶电泳纯化后，使用BRL公司测序试剂盒，采用双脱氧末端终止法测序。

结果

1.PCR扩增结果：外显子17-21片段长度分别为317 bp、214 bp、285 bp、208 bp、291 bp。

2.PCR-SSCP分析结果：在89例NIDDM样品中，发现11例外显子17突变，正常对照为A电泳带型，突变分为B、C两种电泳带型(图1)。1例外显子20突变，外显子18、19、21未发现突变。

第2道为正常对照A带型，其余为被检测样品，箭头所示为异常电泳条带，

分为B、C两种，同种带型具有相同的突变。

1胰岛素受体基因外显子17的SSCP电泳结果

3.核酸序列分析结果：外显子17 B、C两种电泳带型各取1例进行序列分析，结果分别为9例、2例CAC¹⁰⁵⁸→CAT¹⁰⁵⁸杂合及纯合多态性突变（图2）。

从左至右为呈现A、B、C三种带型的样品。A为正常对照，

B、C分别为CAC¹⁰⁵⁸→CAT¹⁰⁵⁸纯合及杂合多态性突变。箭头所示为突变碱基。

2胰岛素受体基因外显子17核酸序列分析结果

讨论

一、PCR-SSCP的影响因素

1.PCR产物的高度特异性，是SSCP成功的前提。首先要优化PCR反应条件，以免非特异扩增带干扰结果分析，其次要避免PCR操作过程中的污染。银染聚丙烯酰胺凝胶电泳检测灵敏度比EB高，可检测出在紫外灯下看不到的非特异带。为了排除干扰带的影响，我们首先在紫外灯下大致判断一下PCR产物的量，若样品间产物量相差较大，用TE调整PCR产物的浓度，使样品间近于相同，以防浓度大的样品出现非特异带。其次，在进行SSCP电泳时，在变性样品的泳道旁边点上同样量的未变性的样品，若未变性样品出现一条以上的带，表明有非特异扩增产物，那么对应的变性样品正常单链带附近的条带就可能不是突变带，反之则为突变带。若双链DNA在聚丙烯酰胺凝胶电泳中出现较多的非特异带，干扰了结果分析，可把PCR产物纯化后再进行SSCP分析(此情况一般很少见到)。最后，对于检测出的突变样品，最好换一种浓度的胶再做一次，若还出现异常带，可确定为突变型。

2.凝胶浓度和交联度、电泳温度是影响PCR-SSCP分析的主要因素。由于各个片段的长度不同，且碱基顺序也不同，所以每个片段都要建立一个最适的电泳条件。

聚丙烯酰胺凝胶的浓度和交联度影响单链DNA的泳动速度和对构象的分辨率，为SSCP分析的关键。因此，有时在一种条件下检测不出突变带，而换个条件则能检出突变，所以宜采用2种以上的电泳条件，以提高突变检出率。

甘油的浓度和电泳的温度影响单链DNA的分离，添加适量甘油有利于凝胶分离DNA单链。升高电泳温度，单、双链DNA泳动快，单链带间距离缩短，单双链间距离拉大，降低温度则相反。但降低温度似乎比添加甘油能更好地分离DNA单链。

二、银染的影响因素

银染色时，试剂最好为优级纯，且要用去离子水新鲜配制，显影液预冷、显影时间加长、显影过程中多次更换显影液可使背景变浅，条带清晰。

银染后的凝胶，用玻璃纸封好，晾干后长期保存。

三、INS-R基因与NIDDM

胰岛素受体基因突变与NIDDM INS-R基因位于人的第19号染色体短臂的末端，为单拷贝基因，包括11个内含子和22个外显子。INS-R是一种糖蛋白，有2个α亚基和2个β亚基，α亚基位于细胞膜外，是胰岛素的主要结合部位，β亚基为一跨膜蛋白，其位于胞浆的部分有一段氨基酸序列由外显子17-21编码，称为酪氨酸激酶域，含有多个酪氨酸残基和ATP结合位点，可发生自身磷酸化。胰岛素首先与INS-R的α亚基结合，激活此区域，然后依次磷酸化细胞内的一系列蛋白质和酶，使激素信号在细胞内传递，产生生理效应。若此区域内的某些碱基发生突变，则可能使正常或高于正常水平的胰岛素不能发挥正常的生理效应，造成胰岛素抵抗和糖耐量异常。目前对具有严重胰岛素抵抗NIDDM患者的INS-R基因突变的研究报道较多，基因突变大部分是在这些患者中检测到的^［2，3］，而对于非严重胰岛素抵抗的NIDDM患者的此类研究还较少。本研究结果为基因错意突变，在普通NIDDM患者中出现的频率较低，由此可以认为INS-R基因突变不是本人群NIDDM发病的主要原因。

总之，PCR-SSCP结合银染技术具有安全、快速、经济、灵敏度高等优点，特别适合于临床大样本基因突变的筛查。胰岛素受体基因突变是普通NIDDM发病的原因之一，但不是主要的致病原因。

参考文献

1Seino S, Seino M, Mell GI. Human insulin receptor gene. Diabetes, 1990,39:123-128.