肿瘤的化学治疗已开始迈入“个体化”化疗阶段，药物敏感性的检测能为临床选择合理的化疗方案提供有力的证据。目前国内较常使用的药物敏感性检测法是四唑蓝比色法（MTT法），但MTT法存在一些缺点，限制了MTT法的广泛使用。二甲氧唑黄比色法(XTT法)^［1］是近年来国外才开始使用的药敏检测方法，本研究以人急性髓性白血病细胞株HL-60作为研究对象，用XTT方法检测HL-60细胞对异搏定(verapamil,VER)和鬼臼乙叉甙(etoposide,VP16)的药物敏感性，探讨XTT法使用的可行性，为国内开展肿瘤细胞药物敏感性的检测，提供新的检验手段，现将结果报道如下。

一、材料与方法

1.细胞株：人急性髓性白血病细胞株HL-60由上海第二医科大学附属瑞金医院陈竺教授惠赠。

2.试剂：VER为江苏省连云港制药厂产品；VP16为北京制药工业研究所实验药厂产品；XTT试剂盒为德国宝灵曼公司产品；RPMI 1640培养基为美国GIBCO公司产品；小牛血清为杭州四季青公司产品。

3.细胞培养：将增殖良好的HL-60细胞以终浓度为2×10⁴/ml，1×10⁵/ml 2×10⁵/ml，1×10⁶/ml分别接种于96孔培养板，100 μl/孔，每个药物浓度均设3个平行孔，并设立空白对照组（RPMI1640培养液）和正常对照组（含HL-60细胞不加药物），置于37℃、5%CO₂培养箱在全湿条件下培养24，48，72小时，以确定最佳细胞浓度和最佳孵育时间^［2，3］。

4.XTT法：取出培养板，每孔中加XTT标记混合液50 ml（使用前将XTT标记液和PMS偶联剂解冻后以50∶1混合），置于37℃、5%CO₂和全湿条件下继续培养4，12，24小时，以确定XTT最佳作用时间，取出后用酶联免疫检测仪测定吸光度A值(波长490 nm)，检测时用空白对照调零^［4］。

5.统计学分析：采用配对t检验，IC₅₀值应用综合计算法^［5］计算。

二、结果

1.最佳细胞浓度和作用时间选择：细胞浓度在2×10⁵/ml时，孵育48小时后测定吸光度A值低于1.0，孵育72小时后，A值大于1.5，细胞浓度为1×10⁶/ml时，孵育48小时后A值在1.5以上，细胞浓度为2×10⁴/ml和1×10⁵/ml时，孵育72小时，A值均在0.5以下，故认为细胞浓度为2×10⁵/ml孵育48小时最为合适。

2.XTT最佳作用时间选择：加入XTT孵育4小时，测定A值在1.0以下，孵育12，24小时后，A值变化不明显，故认为孵育4小时较合适。

3.VER和VP16对HL-60细胞的IC₅₀：VER对HL-60细胞的IC₅₀值为26.13 μg/ml，5 μg/ml VER对HL-60细胞无明显毒性，当VER浓度＞5 μg/ml时呈毒性增加趋势。用VER 5 μg/ml预处理1小时后，VP16对HL-60细胞的IC₅₀值从247.17 ng/ml下降为143.22 ng/ml，增敏1.73倍。

三、讨论

二甲氧唑黄(2，3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)5［(phenylamino)carbonyl］-2H-tetrazolium hydroxide，XTT)比色法（XTT法）作为一种药敏检测法是1988年由Scudiero^［1］最先报道的。XTT的作用原理为：活细胞线粒体中存在与辅酶Ⅱ相关的脱氢酶，可将黄色的XTT还原成水溶性的橘黄色的甲瓒，不形成颗粒，可直接用酶联免疫检测仪检测A值，因与MTT类似，故而简称为XTT。单独XTT对很多人肿瘤细胞的检测效率比MTT低，但在增加了一个偶联剂PMS(phenazine methosulfate)后，大大提高了XTT的检测效率，所以目前XTT方法检测药敏越来越得到人们的重视。

本法通过对HL-60细胞药敏的检测，摸索了XTT方法检测药敏时最佳细胞浓度和最佳药物孵育时间以及XTT最佳作用时间，并证实VER和VP16对HL-60细胞的IC₅₀分别为26.13 μg/ml和247.17 ng/ml，VER可提高HL-60细胞敏感性1.73倍，与文献报道一致，说明XTT方法检测药敏方法与MTT法一样可靠，而它操作简便，弥补了MTT的不足。

在试验过程中应注意以下问题：(1)接种时细胞的浓度和均匀程度；(2)孵育应在全湿条件下，否则因为干燥影响培养板四周孔，A值误差较大；(3)测定A值前96孔板放在振荡器上摇匀；(4)XTT作用时间一致；(5)XTT标记液和偶联剂应避光保存，计算出用量，避免反复解冻、冻存。(6)酶联免疫检测仪测定A值的波长可在450～500 nm之间，对照波长应超过650 nm。

根据我们的试验结果和方法学评价可以认为，XTT法与国内目前常用的其他药敏检测方法相比，它操作简便、数据客观、重复性好、无同位素污染，适用于贴壁细胞和悬浮细胞的检测。

本课题受铁道部科学基金资助(基金编号：J9713)

参考文献

1Scudiero DA, Shoemaker RH, Paull KD, et al. Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines. Cancer Res,1988,48:4827-4833.

2Turtinen LW, Juran BD. Standardization and comparison or an XTT based TNF arpna bioassay with a TNF-arpha ELISA.Biotechniques,1998,24：232-234,236-238.

3Boayue KB, Gu L, Yeager AM, et al. Pediatric acute myelogenous leukmia cells express IL-6 receptor and are sensitive to a recombinant IL6-Pseudomonas exotoxin. Leukemia, 1998, 12:182-191.

4Jackson JK, Burt HM, Oktaba AM, et al. The antineoplastic ether lipid, s-phosphonate, selectively induce apoptosis in human leukemic cells and exhibits antiangiogenic and apoptotic activity on the chorioallantoic membrane of the chick embryo. Cancer-Chemother-Pharmacol, 1998,41:326-332.

5徐叔云，编.药理实验方法学.第2版.北京：人民卫生出版社，1992：203-205.

(收稿：1998-08-24修回：1998-11-24)