关键词： 白血病；聚合酶链反应；药物耐受性；基因

【摘要】目的建立灵敏、客观和量化的检测白血病细胞中多药耐药基因(MDR1)表达的方法和判定MDR1基因表达阳性的标准，合理评价MDR1基因在白血病耐药表型中所起的作用。方法用地高辛标记的脱氧三磷酸尿苷(DIG-11-dUTP)掺入逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法，检测耐长春新碱的多药耐药细胞株HL-60/VCR细胞中MDR1表达，设立MDR1表达的半定量稀释曲线，以此为标准检测了9种不同类型的肿瘤细胞株和43例初治急性非淋巴细胞白血病(ANLL)患者MDR1的表达。结果梯度稀释HL-60/VCR的RNA含量与其相对应MDR1基因扩增产物有较好的线性关系，将RNA稀释2⁷倍时所扩增出的MDR1/β-actin产物量之比0.2作为MDR1表达阳性的界定。9种细胞株中，HL-60/VCR MDR1表达高水平，KG-1有一定水平的表达，其它细胞株中未检测到MDR1基因的表达。所检测的43例ANLL标本中，共有13例MDR1阳性，占总数的30.2%，MDR1阳性与MDR1阴性患者的完全缓解率分别为23.1%和86.7%(P＜0.005)，不同ANLL亚型中MDR1表达率依次为M₁＞M₅＞M₄＞M₂＞M₃，杂合性白血病中也有较高的表达率。结论DIG掺入的RT-PCR检测MDR1半定量检测方法和判定指标客观可行，MDR1表达与临床耐药表型密切相关，MDR1检测对临床判断化疗疗效，预测预后有较大意义。

Analysis of MDR1 gene expression in leukemia by DIG labeled RT-PCR.WANG Wei, CEN Jiannong, LI Jianyong, et al. Jiangsu Institute of Hematology, First Affiliated Hospital of Suzhou Medical College, Suzhou 215006

【Abstract】ObjectiveTo establish an objective and quantitative criterion for the assessment of MDR1 gene expression and to evaluate the effect of MDR1 gene action on drug resistance in leukemia.MethodsUsing DIG-11-dUTP labeled RT-PCR assay, we established a semi-quantitative curve of MDR1 expression in a multidrug resistance cell line HL-60/VCR. On the basis of this standard, MDR1 gene expression was determined in nine tumor cell lines and 43 cases of ANLL.ResultsA MDR1/β-actin ratio of 0.2 was set as the positive standard of MDR1 gene expression. The HL-60/VCR cell line highly expressed MDR1 gene and KG-1 cell line also had MDR1 gene expression while the expression in other cell lines was negative. In all 43 cases, the positive rate of MDR1 expression was 30.2%. 23.1% of MDR1 positive case achieved CR which was markedly lower than 86.7% in MDR1 negative cases (P＜0.005). Different subtype of leukemia showed different expression ratio. ConclusionsThe method and the criterion that we established using DIG labeled RT-PCR assay are objective and feasible. MDR₁ gene determination is helpful in estimating the response to chemotherapy and predicting prognosis.

【Key words】LeukemiaPolymerase chain reactionDrug resistanceGenes

耐药是肿瘤和白血病化疗失败的重要原因，耐药基因MDR1的高表达是肿瘤细胞产生多药耐药(MDR)表型的最直接和主要的原因之一^［1］。目前对耐药表型的研究方法各异，单纯RT-PCR扩增MDR1基因产物仅为定性，各家判定标准不一，不易量化，给比较MDR1的阳性率带来不便。我们试图以MDR表型显著、具有P-糖蛋白(P-gp)/MDR1高表达的白血病细胞株HL-60/VCR为参照，应用更敏感的地高辛(DIG)掺入半定量RT-PCR方法，检测细胞株和白血病患者MDR1基因表达，建立较为客观、量化的阳性指标，以便更合理地评价MDR1基因在白血病耐药表型中所起的作用。

材料和方法

1.白血病和肿瘤细胞株：人类髓细胞白血病细胞株HL-60，低度耐药亚株HL-60NV，维甲酸耐受亚株HL-60R′，早幼粒细胞白血病细胞株NB₄，原粒细胞白血病细胞株KG-1，单核细胞白血病细胞株THP-1，慢性粒细胞白血病细胞株K₅₆₂，膀胱癌细胞株T₂₄，为本室保存。耐药亚株HL-60/VCR由美国纽约Sloan-Kettering癌症研究所引进，在本研究室经多年培养和VCR筛选，具有高度耐药表型，VCR对它的半数抑制剂量ID₅₀为1 947.2 ng/ml，而VCR对母株的ID₅₀只有3.9 ng/ml。所有细胞在含15%小牛血清的RPMI 1640培养液中37℃，全湿度培养，3天传代一次，耐药细胞实验前一代停止给药。

2.临床病例：43例ANLL患者均为我院收治，按FAB标准诊断分型，大多经免疫分型和细胞遗传学证实，其中M₁ 10例，M₂ 10例，M₃ 10例，M₄ 3例，M₅ 7例，M₆ 1例，急性杂合细胞性白血病(HAL)2例。男25例，女18例。中位年龄38.3岁(15～64岁)。

3.RNA制备：取患者肝素抗凝外周血5 ml或骨髓2～5 ml，Ficoll淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)分离单个核细胞，计数后加10%二甲亚砜冻于液氮备用。采用异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法提取对数期生长的培养细胞及患者标本总RNA，紫外分光光度计定量。

4.cDNA合成：逆转录体系40 μl，标本总RNA 1 ug，5×逆转录反应缓冲液8 μl，二硫苏糖醇(DTT)10 μmol/L，dNTPs 500 μmol/L，RNasin 50 U，六随机引物100 ng，逆转录酶M-MLV 200 U(GIBCO公司)，70℃变性5分钟，37℃反应45分钟，95℃5分钟。

5.PCR引物：由上海生工公司合成。

MDR1 (157 bp) sense：5′-CCCATCATTGCAATAGC-AGG-3′，antisense：5′-GTTCAAACTTCTGCTCCTGA-3′。

β-actin (366 bp) sense：5′-ACACTGTGCCCATCTAC-GAGGGG-3′，antisense：5′-ATGATGGAGTTGAAGGTA-GTTTCGTGG-AT-3′。

6.PCR扩增：反应体系50 μl，包括逆转录产物10 μl，寡核苷酸引物各100 ng，10x缓冲液5 μl，dNTP 200 μmol/L，DIG-11-dUTP 2 μmol(Boehringer Mannheim公司)，Taq DNA酶1.5 U(上海生工公司)，95℃变性5分钟，94℃变性30秒，55℃退火60秒，72℃延伸75秒，27个循环，72℃7分钟。^［2］

7.DIG掺入PCR产物分析：取适量PCR产物，在2%琼脂糖凝胶上进行电泳(100 V，1.5小时)，凝胶经碱变性，10×SSC平衡，用Southern Blot方法将产物吸引至尼龙膜上，洗膜，封闭，将连有碱性磷酸酶(AP)的抗DIG抗体(Anti-DIG-AP)的Fab片段结合至产物上，加入AP的发光底物CSPD，在X光片上化学发光数分钟显影，洗片后即可显示检测条带。X光片在GS-300透射/反射光密度扫描仪(Hoefer公司)上进行扫描定量，计算MDR1与β-actin的比值，示MDR1基因表达水平。

8.HL-60/VCR细胞的RNA按1∶1倍比稀释至2¹²倍，RT-PCR扩增出各点的MDR1产物，分别与未稀释点扩增的内对照β-actin产物进行比较，根据扫描得到的MDR1与β-actin的比值建立MDR1表达的半定量稀释曲线。

9.统计学处理采用t检验或卡方检验

结果

1.HL-60/VCR表达强阳性，不同稀释点MDR1扩增情况如图1，经光密度扫描定量，建立了图2的半定量稀释曲线。

1→9∶2^-4→2^-12稀释

M：Marker Ⅵ，DIG标记(Boehringer Mannheim产品)

1DIG标记的PCR检测HL-60/VCR细胞中MDR1基因的表达

RNA稀释度

2HL-60/VCR细胞中MDR1表达的半定量稀释曲线

HL-60/VCR RNA经递减稀释，扩增出不同量的MDR1产物，模拟了具有不同ID₅₀即不同耐药程度的一系列耐药株的耐药程度。当RNA稀释2⁷倍，相当于ID₅₀15.2 ng/ml(为母株的4倍)时的耐药状态时，MDR1/β-actin的比值为0.2。根据理论推断，结合患者临床资料，我们将大于此值定为检测临床标本MDR1表达阳性的标准。

2.根据以上标准，在9种细胞株中，HL-60/VCR、KG-1细胞MDR1表达为阳性，其余细胞株表达均为阴性。见图3。

M：Marker；1：HL-60；2：HL-60NV；3：HL-60(VCR)；4：HL-60R′；

5：NB4；6：KG-1；7：THP-1；8：K562；9：T24

3DIG标记的RT-PCR检测白血病及肿瘤细胞株中MDR1基因的表达

3.同样按照以上所订标准，43例ANLL患者中，MDR1表达阳性13例，阳性率30.2%。MDR1与急非淋各亚型之间的关系见表1。