关键词： 胆固醇酯类；载体蛋白质类

【摘要】目的建立一种新的分离纯化人血清胆固醇酯转运蛋白(CETP)的方法，为制备CETP单克隆抗体和CETP浓度测定提供物质基础。方法制备无脂血清，用Butyl-Sepharose 4FF、CM-Sepharose FF和Sephacryl S-200三步柱层析分离、纯化CETP。结果纯化CETP经SDS-PAGE电泳鉴定呈单一区带，分子量65 000，蛋白质含量0.325 mg/ml，与国外和作者研制CETP单抗的免疫斑点试验呈特异性反应，与纯化脂蛋白(a)、载脂蛋白(Apo)A1、ApoB、IgG、IgA、IgE、C₃、C₄抗体无免疫反应。结论经三步柱层析获得了纯化CETP，得率约25%，活性每小时30 nmol/μg。

Purification and identification of cholesteryl ester transfer proteinZHUANG Yiyi, WANG Junjun, LI Yong. Department Biochemistry, Nanjing General Amry Hospital, Nanjing 210002

【Abstract】ObjectiveTo separate and purify human serum choleseryl ester transfer protein (CETP).MethodLipoprotein-free serum, purification of CETP was completed by butyl-sepharose 4FF, CM-sepharose FF and sephacryl S-200 column chromatographic proceduces.ResultsThis purified protein was confirmed as a human CETP by SDS-PAGE, specific immunoreaction with CETP monoclonal antibodies and CETP activity determination. The activity was 30 nmol/μg/h. The recovery rate was about 25%.ConclusionThe method contributes to preparation of CETP monoclonal antibody and determination of CETP concentration.

【Key words】Cholesteryl estersTransfer proteins

胆固醇酯转运蛋白(CETP)调节脂蛋白之间中性脂肪和磷脂的转运。人CETP的主要功能是介导高密度脂蛋白(HDL)、胆固醇酯(CE)与低密度脂蛋白(LDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)、甘油三酯(TG)之间的交换，决定HDL和LDL质和量的变化，在胆固醇逆向转运中起关键作用，与动脉粥样硬化(AS)发生和发展密切相关^［1，2］。CETP为疏水性糖蛋白，人CETP的cDNA为476氨基酸，分子量53 000；成熟CETP含4个天冬酰胺N-糖基，分子量约70 000，等电点4.6～5.4^［3］。我们参考国外文献［4，5］，用三步柱层析法从血清中分离、纯化CETP，经SDS-PAGE、特异性单克隆抗体免疫反应和活性测定等检定证实是纯化CETP，为制备CETP单抗和血清CETP浓度测定提供了物质基础，为AS实验和临床研究提供了新的途径。

材料和方法

一、材料

1.柱层析材料：Butyl-Sepharose 4FF、CM-Sepharose FF、Sephacryl S-200均为pharmacia产品。

2.Bio-Red层析仪：Biologic Lp具自动梯度洗脱、部分收集和280 nm检测记录装置。

3.CETP活性测定试剂：(1)［¹⁴C］胆固醇油酸酯，比活性50 Ci/mol(Amersham)。(2)蛋卵磷脂(Sigma产品)。(3)5，5-dithiobis (2-nitrobenzoic acid, DTNB, Fluka)。(4)LDL［d：(1.025～1.045) g/ml］、HDL［d：(1.070～1.100) g/ml］：本室用硫酸葡聚糖(DS，分子量500 000 Sigma产品)和Ca²⁺沉淀结合超速离心法制备，不含脂蛋白(Lp)(a)。

4.SDS-PAGE：Bio-Red电泳仪3000 Xi，分子量标准Promega产品。

5.CETP单克隆抗体：美国Urjohn实验室Melchior博士赠送。

6.链霉菌抗生物素蛋白-过氧化氢免疫组化染色试剂盒：福州迈新生物技术开发公司。

二、方法

1.无脂血清制备：2L新鲜献血员血清，加DS 6g(溶于200 ml 1 mol/L CaCl₂中)，2小时后4 000 r/min离心20分钟，倾出上清，加16 g草酸钾粉末，混均溶解，4小时后4 000 r/min离心20分钟，倾出上清，加入240 g NaCl调至2 mol/L浓度，过夜，4 000 r/min离心20分钟，倾出上清即为无脂血清，约2 100 ml待上第一柱层析。

2.Butyl-Sepharose 4FF柱层析：柱4 cm×30 cm，用50 mmol/L、pH 7.4 Tris-HCl(含2 mol/L NaCl、0.1 mmol/L EDTA)平衡，无脂血清上柱，5 ml/min，上柱完毕后用500 ml、50 mmol/L、pH 7.4 Tris-HCl流洗。用50 mmol/L和3 mmol/L、pH 7.4 Tris-HCl(含0.1 mmol/L EDTA)各500 ml作递减梯度洗脱，流速5 ml/min，梯度洗脱完毕后再用3 mmol/L、pH 7.4 Tris-HCl和蒸馏水各500 ml洗脱，收集10 ml/管，根据280 nm吸收峰和CETP活性测定收集90～125管共350 ml。另备1 cm×10 cm Butyl-sepharose浓缩柱，按上述操作使CETP吸附、洗脱、浓缩成40 ml，用0.1 mol/L pH 5.5枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液透析、平衡，待上第二柱层析。

3.CM-Sepharose FF柱层析：柱2 cm×20 cm，0.1 mol/L pH 5.5枸橼酸缓冲液平衡，0.1 mol/L pH 5.5枸橼酸缓冲液100 ml和含1 mol/L NaCl、0.1 mol/L pH 5.5枸橼酸缓冲液100 ml作递增梯度洗脱，流速5 ml/10min，收集5 ml/管，根据280 nm吸收峰和CETP活性取26～35管共50 ml，置透析袋中4℃吹干至10 ml。用50 mmol/L、pH 7.4 PB(含0.15 mol/L NaCl、0.1 mmol/L EDTA)透析平衡待上第三柱层析。

4.Sephacryl S-200柱层析：柱2.5 cm×38 cm，用50 mmol/L、pH 7.4 PB(含0.15 mol/L NaCl、0.1 mmol/L EDTA)平衡，上样，并用同样缓冲液洗脱，1 ml/min，3 ml/管，根据280 nm吸收峰和CETP活性取13～21管共27 ml，置透析袋4℃吹干至4 ml，用以上PB缓冲液透析，加入4 mg NaN₃待检定。

5.CETP活性测定^［6］：以［¹⁴C］胆固醇油酸酯标记LDL作为CE供体，HDL为受体，检样与LDL、HDL孵育37℃、16小时后用DS-Mg²⁺沉淀LDL，测定上清液HDL放射性计算CETP活性、活性单位每小时nmol/ml，加入DTNB抑制卵磷脂胆固醇酰基移转酶活性的干扰。

6.CETP与CETP单克隆抗体免疫反应：4 cm×1.5 cm硝酸醋纤膜上滴加纯化CETP(0.1 mg/ml)2 μl，用50 g/L牛白蛋白0.5 ml封闭37℃、1小时，加入15 μl国外CETP单抗或本室纯化CETP制备的单抗，对照加本室制Lp(a)单抗及小鼠血清，37℃、12小时，用0.01 mol/L、pH 7.4 Tris-HCl缓冲液浸泡3次，每次10分钟，依次加生物素标记抗鼠抗体、链亲和素-H₂O₂酶、DAB-H₂O₂呈色液，阳性反应呈棕色斑点。

7.蛋白质含量测定：Lowry法蛋白质定量，牛血清白蛋白作标准。

结果

一、CETP三次柱层析分离、纯化血清CETP的层析图

1.Butyl-sepharose 4FF柱层析：在低离子强度下，洗脱体积1 200 ml和1 600 ml处出现二个蛋白质峰，CETP活性峰在1 000 ml处(图1)。

图1Butyl-sepharose 4FF柱层析

2.CM-sepharose FF柱层析：NaCl梯度洗脱在100 ml出现蛋白质峰，但CETP活性峰在160 ml处(图2)。

图2CETP提纯的CM-sepharose FF柱层析

3.Sephacryl S-200柱层析，PB洗脱60 ml和150 ml出现二个蛋白质峰，CETP活性峰与第一蛋白质峰重合(图3)。

图3CETP提纯的Sephacryl S-200柱层析

二、CETP鉴定

1.SDS-PAGE：纯化CETP的SDS-PAGE呈单一区带，分子量65 000(图4)。

1.标准分子量蛋白质，2.血清，3.纯化CETP

4纯化CETP的SDS-PAGE

2.蛋白质含量：0.325 mg/ml。

3.纯化的CETP与CETP单抗免疫反应：纯化CETP与国外CETP单抗和本室制CETP单抗显示棕色斑点(图5)，与Lp(a)单抗不呈色。用琼脂糖扩散法检定，纯化CETP与抗白蛋白、载脂蛋白(Apo)A1、ApoB、IgG、IgA、IgE、C3、C4等多种多克隆抗体均无免疫沉淀反应。

1.国外CETP单抗，2.LP(a)单抗

3.本室CETP单抗，4.小鼠血清

5CETP单抗免疫斑点试验

4.纯化CETP的活性：每小时30 nmol/μg/h。

讨论

1.人血清CETP平均浓度1