关键词： 基因，Myc聚合酶链反应喉肿瘤

【摘要】目的建立同时检测Myc基因3个成员L-myc 、N-myc及C-myc异常扩增的简便方法。方法采用聚合酶链反应(PCR)技术，用一对引物同时扩增Myc基因3个成员第2外显子中的高度保守区，扩增产物经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及激光扫描。结果此法可以检测Myc基因家族中3个成员的扩增情况。 经检测，正常组织细胞没有Myc基因扩增，32例喉癌组织中47%有L-myc和C-myc扩增，41%有N-myc 扩增，与正常比差异均有显著意义(χ²=6.764,7.609, 5.961;P均＜0.05)。C-myc扩增率与用PCR-琼脂糖凝胶电泳检测的结果基本相符(χ²=0.254,P＞0.05) 。结论此法对检测肿瘤组织中Myc基因3个成员提供了简易、特异、 无放射污染，并且适于临床应用的、优于PCR-琼脂糖凝胶电泳的方法。

A simple PCR for detecting 3 members of Myc geneQuan Chengshi, Guo Xiaofeng, Liu Ming. Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery,First Teaching Hospital, Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun 130021

【Abstract】ObjectiveTo establish a simple method for detecting abnomal amplification of Myc gene family included 3 members(L-myc, N-myc and C-myc) at the same time.MethodOne pair primer was used to amplify the high conservative region in exon 2 of 3 members of Myc gene by PCR.A PCR-PAGE-laser scanning technique was applied.ResultsThere was no amplification of Myc gene in the nomal laryngeal tissues.The amplification of abnormal L-myc and C-myc gene was 47%,and the abnormal N-myc gene was 41% in 32 cases of laryngeal cancer.The C-myc amplification rate coincided with the result of detecting with PCR-agaroe gel electrophoresis(χ²=0.254,P＞0.614).ConclusionThis method is free from radiactive pollution. It is better than the traditional way of PCR-agarose gel eleatrophoresis test and is useful in detecting 3 members of the Myc gene.

【Keywords】Genes, mycPolymerase chain reactionLaryngeal neoplasms

至今Myc基因已被发现了至少3种，C-myc、N-myc和L-myc^［1，2］，3者在第2外显子中有2个区域高度同源，3个基因分别表达各自独立的蛋白，它们的生理作用基本一致。研究表明，在许多肿瘤细胞中有Myc基因扩增或异常表达，但在不同的肿瘤组织和癌细胞系中，Myc基因家族的成员在扩增或表达方面有些差异。因此，深入研究Myc基因3个成员与人类肿瘤的关系非常有意义。本研究建立的PCR-非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳-激光扫描技术，可同时检测肿瘤组织中3种Myc基因的扩增情况，在肿瘤发生发展过程中，为进行3种基因各自作用机理的研究提供了简易的实验手段。

材料及方法

一、材料

1.标本：32例喉癌组织取自我院耳鼻咽喉科住院病人，7例正常喉组织取自我科同期住院的非癌症病人，3例正常白细胞取自我院血库人全血。所有标本均经病理证实。根据喉癌组织病理分化程度不同，分为高、中、低分化癌。

2.PCR引物：5′-CCCAGCGAGACATCTGGAAGAA-3′，5′-GAGAAGCCGCTCCACATGCAGTC-3′。扩增Myc基因家族的3个基因，即C-myc(244 bp)，N-myc(230 bp)，L-myc(227 bp)，由上海复旦大学遗传学研究所合成。

3.试剂：TaqDNA聚合酶、dNTP为Promega公司产品；蛋白酶K为Merke公司产品；硝酸银为沈阳试剂二厂产品；Marker PUC 18质粒DNA HeaⅢ酶切片段为Sigma公司产品。

二、方法

1.模板DNA提取：参照参考文献［3］方法进行。

2.PCR扩增：PCR扩增总反应体积50 μl，应用模板DNA 50 ng，在DNA扩增仪操作(Perkin Elmer Cetus)，循环周期为94℃1分钟，55℃1分钟，72℃2分钟，经过30个循环后，补加72℃7分钟。

3.琼脂糖凝胶电泳步骤：取PCR产物5 μl加1μl上样缓冲液(0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯氰FF，40%蔗糖水溶液)之后备用。制备2%琼脂糖凝胶倒入水平式电泳槽中。待胶凝固后加样，用1×TAE缓冲液作为电极缓冲液，溴化乙锭染色，电压低于5V/cm，时间约为2小时。电泳结束后，凝胶直接在紫外透射仪上观察结果。照像，拍片后的底片在激光扫描仪上进行扫描。

4.非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤：取PCR产物5 μg加1 μl上样缓冲液之后备用。制备8%非变性聚丙烯酰胺凝胶，灌注于20 cm×20 cm×0. 1 cm垂直板电泳槽中， 待凝胶聚合后加样，用1×TBE缓冲液作电极缓冲液，室温下电泳1瓦特约14小时，待指示剂溴酚蓝移到边缘时停止电泳。将电泳后的凝胶移至方盘中进行硝酸银染色。染色过程如下：用双蒸馏水(dH₂O)洗凝胶3次后浸泡于染色液(硝酸银1g，加dH₂O至500 ml)中30分钟，去掉染色液，用dH₂O漂洗3次凝胶，然后浸泡于显色液(NaOH15g，38%甲醛3.8 ml，加dH₂O至500ml)中约10分钟，当显出棕黑色DNA区带时，用dH₂O洗1次凝胶后，浸于停影液(冰醋酸25 ml，加水至500 ml)中约30分钟，然后把凝胶移至固定液(乙醇25 ml，冰醋酸2.5 ml加dH₂O至500 ml)中固定。固定后的凝胶在看片灯上观察结果、拍照片，凝胶直接在激光扫描仪进行扫描。

结果

1.PCR-琼脂糖凝胶电泳结果：实验设计的引物扩增Myc 3种基因，经PCR扩增，喉癌组织及正常组织细胞DNA在琼脂糖凝胶上均可见2条小于300 bp 的电泳带。第1条带为N-myc( 230bp)和L-myc(227 bp)2个DNA片段合成带，因两者只相差3 bp，故琼脂糖凝胶电泳不能将其分开而呈现1条带；第2条电泳带为C-myc基因(244 bp)。 将电泳结果拍照后的底片在激光扫描仪进行扫描，得出2条带的峰面积值。正常组织细胞的C-myc带比N-myc和L-myc合成带密度弱，比值小于1，求出正常组织细胞的C×(N+L)^-1均值为0.6 。

C-myc扩增倍数＝喉癌的C×(N+L)^-1×0.6^-1，考虑实验中的综合因素，定为1.5倍以上有C-myc扩增。结果显示：喉癌中有42%的C-myc扩增，正常组织细胞没有C-myc的扩增。

2.PCR-中性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果：由于中性聚丙烯酰胺凝胶电泳对DNA的分离特性，经PCR扩增后的Myc基因电泳带显示3条。第1条带为L-myc(227 bp)，第2条为N-myc(230 bp)，第3条为C-myc(244 bp) 。将扩增出特异性Myc基因电泳带的凝胶片，直接在激光扫描仪上进行扫描，得出3条带的峰面积值。然后用各自的峰面积值除以各自的碱基数，作为该基因的单拷贝数，将L-myc、N-myc和C-myc三者中最小的单拷贝数设定为1，比较其他2个基因的相对倍数。正常组织细胞L-myc∶N-myc∶C-myc均值为1.0∶2.2∶3.8。结果32例喉癌中47%有L-myc和C-myc的扩增，41%有N-myc扩增。C-myc的扩增率与用PCR-琼脂糖凝胶电泳检测的结果基本一致(χ²=0.254，P＞0.614)。

讨论

目前，国内外用于检测N-myc、L-myc及C-myc的方法大多采用各种杂交技术^［4，5］。由于应用放射性同位素，需要各种防护措施，不安全又复杂，且一次只能检测Myc基因家族中的一个基因，临床上很难常规应用。PCR－琼脂糖凝胶电泳技术简单、易行、快速，但由于灵敏度低，不能分开只相差3个bpDNA的L-myc和N-myc，所以只能检测C-myc的相对扩增，而不能检测N-myc或L-myc扩增或二者的同时扩增。而且，如果有N-myc或L-myc扩增或二者同时扩增时，即使有C-myc扩增，也会出现假阴性结果。我们首先把PCR技术与中性聚丙烯酰胺凝胶电泳及激光扫描技术结合起来，并用硝酸银试剂使凝胶上的Myc 基因双链染成黑褐色。这样的实验结果特异性高，方法简单，成本低，又避免了放射性同位素的一切弊端，很适合于临床应用。聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率高于琼脂糖凝胶电泳，具备分离只相差一个核苷酸的不同DNA片段的特性。在中性聚丙烯酰胺凝胶中，双链DNA片段的电泳迁移率主要由DNA片段长短决定，而与其碱基组成和顺序基本无关。基于以上原理，我们设计了此实验，目的是能把琼脂糖凝胶电泳上没有分开的只相差3 bp的N-myc和L-myc分开，作到一次可同时检测3种Myc基因的扩增情况。实验表明：用PCR-中性聚丙烯酰胺凝胶电泳和用PCR-琼脂糖凝胶电泳检测C-myc基因结果基本相符， 说明本研究建立的方法结果可靠。Myc基因是较早发现的一组癌基因，Myc基因的异常扩增或表达，参与了很多肿瘤的发生和发展。本研究方法对进行3种Myc基因在肿瘤形成过程中作用机理的研究，提供了简便易行的实验手段。

作者单位：130021 长春，白求恩医科大学第一临床学院耳鼻咽喉-头颈外科

参考文献

1Schwab M, Varmus HE, Bishop JM.Human N-myc gene contributes to neoplasformation of mammalian cells in culture. Natur, 1985,316:160-162.

2Nau MM,Brooks BJ,Battey J, et al. L-myc,a new myc related gene amplified and expressed in human small cell lung cancer. Natur, 1985,318