关键词： 聚合酶链反应衣原体感染泌尿生殖系统疾病

【摘要】目的建立一种敏感、特异、快速诊断女性生殖道沙眼衣原体(CT)感染的方法。方法应用套式聚合酶链反应(NPCR)技术和直接荧光(DFA)法检测女性生殖道沙眼衣原体。对两者结果不符的标本用细胞培养法验证。结果300份受检标本，DFA法阳性71份，阴性229份，NPCR法阳性90份，阴性210份；其中NPCR和DFA均为阳性者68份，另有22份NPCR阳性，而DFA为阴性，再经细胞培养证实系阳性。但另有3份DFA阳性，NPCR却为阴性，再经细胞培养证实亦属阳性。综合NPCR与DFA并对照细胞培养，结果显示NPCR的敏感性为96.7%(90/93)，特异性为100%(207/207)，DFA的敏感性为76.3%(71/93)，特异性为100%(207/207)。结论NPCR技术与DFA法检测CT感染，均具有高度特异性、操作简便等优势；NPCR的敏感性优于DFA法；DFA法具有费用低、重复好的特点。两法结合起来检测CT，将获得理想的检测效果。

Chlamydia trachomatis in female genital tract detected by nested polymerase chain reaction and direct fluoscent analysisYao Bing^*, Yang Yueqin, Zhu Qiding. ^*Department of Clinical Laboratory of No.454 Hospital of PLA; Research Center of Reproduct of Nanging Medical University, Nangjing 210002

【Abstract】ObjectiveTo establish a method for sensitive, selective and speed diagnosis of chlamydia trachomatis (CT) infected in female genital tract.MethodsCT in female genital tract was detected by NPCR and DFA. Discrepant results between NPCR and DFA were further analyzed by cell culture.ResultsIn 300 tested samples, 68 were both positive reaction of NPCR and DFA, 22 were NPCR positive but DFA negative, whereas 3 were DFA positive and NPCR negative. These discrepant samples were further determined by cell culture and all were positive. NPCR had a sensitivity of 96% (90/93) and a specificity of 100%(207/207). DFA showed a sensitivity of 76.3%(71/93) and a specificity of 100%(207/207).ConclusionsThe results suggested that NPCR had a higher sensitive, selective and simple procedure, DFA is rapid, simple, sensitive and selective. Combined NPCR with DFA to detect CT, will show satisfied results.

【Keywords】Polymerase chain reactionChlamydia infectionsUrogenital diseases

沙眼衣原体(CT)是目前最常见的性传播疾病之一，其经典的检测方法是细胞培养分离沙眼衣原体，但该法要求较高的实验室条件及操作技术，难以普遍开展。目前，聚合酶链反应(PCR)技术正不断用于临床标本中CT感染的检测，但常因假阳性而干扰其在临床检测中广泛应用。套式PCR(NPCR)是应用两对引物先后扩增靶片段的一种PCR技术，即先用一对外侧引物进行第一次扩增，再将第一次扩增产物作为模板，用另一对内侧引物对其扩增，保证了结果的特异性和敏感性^［1］。直接荧光(DFA)法是检测CT感染的一项新兴技术，该法检测CT可获得较高的灵敏度和特异性^［2］。我们将NPCR技术和DFA法联合用于检测CT感染，并用细胞培养法加以验证，取得了理想的检测效果。

材料和方法

一、材料

1.标本来源：女性患者临床标本300份，均取自南京医科大学生殖医学研究中心，年龄18～50岁。

2.仪器和试剂：TaqDNA聚合酶，dNTP和Tris等试剂均购自上海复华公司；1640培养基购自美国Promega公司；PTA-51B DNA热扩增仪，军事医学科学院产品；Othoplan荧光显微镜，德国生产。

二、方法

1.标本的采集和保存：将两个无菌棉拭子插入女性宫颈内2～3 cm，旋转拭子，停留10秒后，一支取出置1.5 ml无菌生理盐水中振荡弃拭子，-20℃冰箱保存，一周内进行PCR检测和细胞培养，另一拭子涂片准备做直接荧光染色。

2.PCR的标本制备：将标本混悬液200 μl，5 000 r/min，离心20分钟，弃上清液，沉淀物中加入80 μl标本裂解液，100℃煮沸10分钟，1 000 r/min，离心15分钟，取上清液做PCR测定。

3.PCR引物及反应条件：选用CT质粒特异性片段的两对引物，第一对引物(外侧引物)：T₁ 5′-GGACAAATCGTATCTCGG-3′(正链)T₂ 5′-GAAACCAACTCTACGCTG-3′(负链)，扩增片段为517 bp^［3］。第二对引物(内侧引物)：Y₁ 5′-TTTGAGCGTGTGTAGCGC-3′(正链)，Y₂ 5′-CCGTATAGATGGCCTAGC-3′(负链)。第二对引物经加拿大多伦多大学医学院blast软件分析，特异性和引物结构符合要求，可扩增364 bp。引物由上海细胞所癌基因室合成。

PCR测定总体积为50 μl，包括30 μl标本悬液，10 mmol/L Tris-HCl(pH8.3)，50 mmol/L KCl，3 μmol/L MgCl₂，4种dNTP的浓度均为120 μmol/L，所用引物的量是12.5 pmol。第一轮PCR测定，将样品DNA在100℃变性10分钟，然后加入2单位Tag DNA聚合酶，按94℃、72℃、50℃各1分钟循环35次，在完成最后一个反应后，72℃延伸5分钟。将第一轮PCR产物做适当稀释，稀释后进行第二轮PCR测定。反应条件同第一轮，两轮反应均在热扩增仪上进行。每批标本设阳性和阴性对照，前者加CT标准株(中国科学院皮肤病研究所提供)，后者加PCR缓冲液。

4.NPCR产物的检测：第二轮反应完成后，取反应产物10 μl在2%琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下观察结果并照像，相应碱基长度处出现与标准株PCR产物在同一水平的砖红色荧光条带即为CT-DNA扩增产物。

5.NPCR产物的特异性分析：将标准株PCR产物经自动DNA序列分析仪(美国PE373-A型)分析，观察其碱基序列。

6.细胞培养：培养前，将标本置37℃水浴融化，旋转振荡取100 μl用于细胞培养。将McCOy细胞置小安瓿内的玻片上，加入0.5 ml 1 640培养液，放置于37℃培养箱哺育24小时，使其在玻片上培养成单层细胞。弃上清液，加临床标本液100 μl，应用低温离心机1 800×g离心50分钟，弃上清液，加入分离培养基(1640培养液中加入放线菌酮)100 μl，培养36小时后经碘液染色，甘油封固，显微镜下观察McCOy细胞内是否有包涵体的形成^［4］。

7.DFA法：将女性宫颈拭子涂片，充分干燥后，置5%吖啶橙液中染色10分钟，然后CaCl₂液分色2分钟，荧光显微镜下观察细胞及胞质内CT所显的特异性荧光及形态^［5］。

结果

1.经自动DNA序列分析仪分析，标准株PCR产物的碱基序列与文献报道的相一致。

2.DFA法：通过荧光显微镜观察发现，在深绿色背景的上皮细胞核周胞质内有致密团块，发桔红色荧光，这一团块即为CT感染上皮后形成的包涵体(图1)。以这种方法检测临床标本300份，其中229份阴性，71份阳性。

图1AO染色后，荧光显微镜下所见上皮细胞中红色的CT包涵体(箭头所指)(10×100)

3.NPCR：将第一轮产物适当稀释后，再进行第二轮扩增，能消除非特异性扩增区带的数目和含量(图2)，以此方法检测的300份标本，210例阴性，90份阳性。

4.细胞培养法：在普通光学显微镜下观察McCOy细胞内CT包涵体，发现McCOy细胞被染成淡黄色，细胞内包涵体呈深棕到淡棕色、圆形、大小一致(图3)。用此法验证DFA法和NPCR技术结果不符的标本，结果，22份DFA阴性而NPCR阳性的标本经细胞培养法验证均为阳性，3份DFA法阳性而NPCR阴性的标本经其验证也为阳性。

5.临床结果分析：以DFA法、NPCR技术对照细胞培养法为标准，则直接荧光法敏感性为76.3%(71/93)，特异性为100%(207/207)，NPCR的敏感性为96.7%(90/93)，特异性为100%(207/207)。

1：阴性对照；2：将第一轮产物稀释1000；3：将第一轮产物稀释100倍；4：将第一轮产物稀释10倍；5：引物Y1Y2临床标本；6：引物Y1Y2标准株；7：引物T1T2临床标本；8：引物

t1T2扩增标准株；9：PCR Marker图2NPCR扩增标准株和临床标本CT-DNA的结果

图3McCOy细胞培养(10×40)箭头所指为CT包涵体

讨论

文献报道，女性CT感染常无特异性症状，若得不到适当治疗常演变为慢性，引起宫颈不典型增生，导致宫颈炎。CT感染可逃避机体的免疫防疫机制长期寄生体内，引起宫颈管和颈管粘液栓的屏障作用消失，逆行至子宫引起子宫内膜炎及输卵管炎，继发女性不孕，和/或宫外孕。孕妇还可因宫内CT感染而引起流产、早产、胎膜早破、低出生体重、胎儿宫内感染及死胎等。CT感染患者还可因性接触传给性伴侣，引起非淋菌性尿道炎等性病。所以，CT感染的早期诊断非常重要，早期诊断早期