单链构象多态性(SSCP)是一种快速、简便、敏感性高的检测基因突变与DNA多态性的技术。为探讨凝胶中的甘油是否对这一技术产生影响，我们应用该技术结合银染法检测肺癌中P₅₃基因第5～8外显子可能存在的点突变，考察了凝胶中甘油的作用。

一、材料与方法

1.10例肺癌患者活检组织、配对外周血由长治医学院附属医院肿瘤科提供。按常规方法提取癌组织及配对外周血DNA。

2.PCR引物及条件：P₅₃基因第5外显子上游引物P5A为：5′-GGATCCTTCCTCTTCCTGCAGTACTCCCCT-3′；下游引物P5B为：5′-GAATTCGCCCAGCTGCTCAC-CATCGCTATC-3′。第6外显子上游引物P6A为：5′-GGATCCCACTGGTTGCTCTTAG-GTCTG-3′；下游引物P6B为：5′-GAATTC-AGTTGCAAACCAGACCTGAGG-3′。第7 外显子上游引物P7A为5′-GGATCCAGTGTTACCTCCTCGGTTGGTTCT-3′；下游引物P7B为：5′-GAATTCACAAGTGGCTCCT-CACCTGGAGTC-3′。第8外显子上游引物P8A为：5′-GGATCCCCTATCCTGAGTG-GTAATCTA-3′；下游引物P8B为：5′-GAATTCTCCTGCTTGCTTACCTCGCTTAGT-3′。扩增条件为：50 μl PCR反应体系中含KCl，MgCl₂，dNTP，Tris*HCl，pH 8.0，引物各0.4 μmol/L，模板DNA 0.2 μg，1.5 uTaqDNA多聚酶。阴性对照用蒸馏水取代模板DNA。以1.5%普通琼脂糖凝胶检测扩增产物。

3.SSCP及银染：取5 μl PCR产物与等量加样缓冲液混匀，95℃变性3分钟后立即置冰上，取3～4 μl相同的样本在A、B二种条件下进行。A条件下凝胶中含5%甘油，B条件下凝胶中不含甘油，其他条件均为：9%非变性聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺=49∶1)，0.5×TBE作电泳缓冲液，恒流10 mA，同一室温下电泳6小时。电泳结束后，取下凝胶进行银染显色。

nD：非变性DNA，B：外周血，T：癌组织，→示异常电泳带，下图同

图15例肺癌样本P₅₃基因第5外显子SSCP检测结果

图22例肺癌样本P₅₃基因第8外显子SSCP检测结果

二、结果与讨论

在A条件下，2，3，8，9号癌组织样本和在B条件下，2，8，9号癌组织样本同样在P₅₃基因外显子5上出现了异常电泳带(图1)。另外，4号癌组织样本在P₅₃基因外显子8上出现了异常电泳带(图2)。

对SSCP结果的判定主要依据癌组织样本中出现与自身正常组织不同的DNA电泳带。因取材关系，实际中因多种因素的影响，出现的DNA带往往多于或少于该理论值。一般认为凝胶中加入甘油能稳定DNA单链构象，因而易于发现因点突变造成的异常电泳带，主张凝胶中加入5%或10%甘油。我们发现2，8，9号样本在两种条件下均能检测到P₅₃基因突变，但3号样本只能在有甘油时才能检测到，4号样本只能在无甘油时才能检测到。这2种条件下分别检测到P₅₃基因突变的频率均为40%。若采用2种条件进行SSCP，则检测到P₅₃基因突变的频率可达50%。进一步对结果分析还可以看出，2，9号样本在A，B条件下电泳异常带均易识别；但8号样本在A条件下异常电泳带易识别得多。在不含甘油和5%甘油的凝胶中进行PCR-SSCP分析，我们认为可提高SSCP技术的准确性与敏感性。

(收稿：1998-01-09修回：1998-04-16)