以往运用聚合酶链反应(PCR)技术检测结核性菌血症阳性率极低，难于满足临床诊断的需要^［1，2］，我们针对该现象对造成假阴性的多方可能性因素进行了调查，并提出相应的防护措施。

一、材料与方法

1.临床资料：结核病组83例，年龄14～90岁，为我院1993年～1997年的住院患者，临床依据症状、体征、X线检查、CT以及病理检查而确诊。非结核病组54例，年龄18～54岁，为同期住院患者中明确排除结核菌感染患者。

2.标准菌株：标准人型结核分枝杆菌(H₃₇Rv)、标准牛型结核分枝杆菌(93006)、鸟分枝杆菌(93008)、胃分枝杆菌(93310)、偶发分枝杆菌(93323)、龟分枝杆菌(93325)、胞内分枝杆菌(93314)、戈化分枝杆菌(93308)、无色分枝杆菌(93311)、牛布鲁菌(55004)购于北京中国药品生物制品检定所。金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、大肠埃希菌(ATCC25922)和绿脓假单胞菌(ATCC27853)由四川省临床检验中心提供。

3.标本收集与处理：取健康献血员血液30 ml(肝素抗凝)，立即加入结核菌生理盐水悬液2滴(含150～200个菌)，5%CO₂37℃孵育3小时，取出等分15份，从每份中吸出100 μl作全血试样，其余血液与2 ml Hank′s液混合，滴加于淋巴细胞分离液上，离心分层，用细针吸取各层200 μl作试样。向全血样品中加入1 ml STE^［3］溶液和5 g/L皂素2滴溶血，离心收集沉淀，并用STE液洗涤两次。向各试样中加入裂解液^［3］50 μl，37℃过夜，稍离心吸上清液做PCR检测。

4.PCR扩增与电泳检测见文献［4，5］方法。

二、结果与分析

1.灵敏度试验：可检测6个标准人型结核分枝杆菌(H₃₇Rv)菌细胞。

2.特异性试验：标准人型结核分枝杆菌(H₃₇Rv)和标准牛型结核分枝杆菌(93006)均为阳性，上述其他分枝杆菌均为阴性，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和绿脓假单胞菌均为阴性。

3.抗凝剂对PCR的干扰试验：106 mmol/L枸橼酸钠、10⁵ U/L肝素和20 g/L双草酸盐水溶液对PCR无干扰，41.1 mmol/L EDTA能完全抑制PCR，稀释EDTA至2.06 mmol/L时抑制现象消失。

4.溶血剂对PCR的干扰试验：采用20.8 mmol/L SDS、40 g/L溴代十六烷基甲胺、QUICKLYSER溶血时，PCR被完全抑制。5 g/L皂素对PCR无干扰。

5.血红蛋白对PCR的干扰试验：20 mg/L的血红蛋白对PCR无干扰。

6.密度梯度离心用试剂对PCR的干扰试验：Hank′S液、PBS(pH 7.2)和Ficoll-Hypaque液均不干扰PCR。

7.临床常用抗生素对PCR的干扰试验：在临床静脉滴注常用剂量下的峰值血药水平上，氧哌嗪西林、苯唑西林、头孢他啶(复达欣)、氟哌酸、环丙氟哌酸(悉复欢)、庆大霉素、卡那霉素、阿米卡星霉素、氯霉素、亚胺硫霉素(泰能)、利福平、新生霉素、制霉菌素、咪康唑对PCR无干扰。青霉素、羟氨苄西林、羧苄西林、头孢唑啉、头孢哌酮、泰利必妥对PCR有明显干扰，可使PCR电泳带的荧光强度与对照带相比减弱50%以上。林可霉素、克林霉素则可完全抑制PCR。

8.不同种类血液样品的PCR阳性率：结果全血PCR阳性率33.33%，单个核细胞(MNC)层86.67%，血浆层26.67%，淋巴细胞分离液层13.33%，红细胞及粒细胞层6.67%。将MNC层与全血及其他分层的PCR结果进行比较，χ²检验P值均小于0.05，说明MNC层阳性率明显高于全血及其他分层，用MNC层受试较使用全血或血浆样品更优越。

9.初步临床应用：82例结核病患者全血阳性5例(6.10%)，血浆层阳性3例(3.7%)，MNC层阳性13例(15.85%)；54例非结核患者全血、血浆及MNC层均阴性。

三、讨论

PCR假阳性问题已引起人们的广泛重视，其假阴性则较为隐蔽不为人重视。PCR对结核性菌血症的诊断以血液标本受试，阳性率较低，在排除引物设计的不严密性、试剂失效、扩增温度不准确甚至停电及操作错误这些可致假阴性的因素外，估计与全血含各种有形成分、药物及药物代谢产物、机体代谢产物等中间的某些PCR抑制剂以及结核菌在血液中浓度低、样本用量少等有关。我们的调查结果表明，检验流程中所使用的某些抗凝剂、溶血剂和某些治疗剂量的抗生素都有不同程度地干扰或抑制PCR扩增，而不同种类的受试血样PCR阳性率本身即存在着显著性差异，这些都是致假阴性的重要因素。有效降低假阴性的发生必须采取以下防护措施。首先，应使用含内质控的PCR试剂盒，以监视每一份PCR单管是否处于最佳扩增条件，及时发现假阴性结果予以纠正。其次，标本采集应以清晨血样进行，一般此时病人血液中的药物浓度最低。第三，标本应以MNC层受试PCR为好，并坚持适当的样品洗涤过程，以除去干扰物质。第四，样品处理过程不使用已明确了的对PCR具有抑制性的试剂。

本研究表明皂素不抑制PCR，可用作全血样品的溶血剂，这与Jonathan等^［1］的报道不一致，估计是使用浓度上的差异所致。Barker等^［2］报道微量血红蛋白便可抑制PCR，但本研究表明小于20 mg/L的血红蛋白对PCR无干扰。

参考文献

1Jonathan Ⅵ, Sritharan VK, Pieciak WS, et al. Diagnosis of Mycobacterium avium Bactermia by Polymerase Chain Reaction. J Clin Microbiol, 1993, 31:1811-1814.

2Barker RH, Portillo PC, Hermans wH, et al. A simple method to detect plasmodium faiciparum directly from blood samples using PCR. Am J Trop Med Hyg, 1993, 46:416-426.

3吴丽娟，邓光贵，张文俊，等.应用聚合酶链反应技术快速诊断结核病.中华内科杂志，1995，34：481-481.

4吴丽娟，邓光贵，江军，等.聚合酶链反应技术诊断泌尿系结核.中华泌尿外科杂志，1995，16：44-47.

5Eisenach KD, Cave MD, Bates JH, et al. Polymerase Chain Reaction amplification of a repetitive DNA sequance specific for Mycobacterium tuberculosis. J Infect Dis, 1990, 161:977-981.

(收稿：1998-01-07修回：1998-04-01)