关键词： 李斯特菌；多态性；随机扩增DNA；DNA探针

【摘要】目的研究一种在微生物遗传背景不清楚情况下，快速制备探针的新方法。方法采用随机扩增DNA多态性技术随机扩增李斯特菌基因组，将其中的单核细胞增生李斯特菌扩增产物克隆制备DNA探针， 探针用聚合酶链反应标记上³²P，与李斯特菌和非李斯特菌进行菌落原位杂交鉴定其特异性。结果获得一长度为850 bp，能与所有李斯特菌特异杂交而不与非李斯特菌反应的李斯特菌属特异探针。结论随机扩增DNA多态性技术为快速制备微生物DNA探针提供了一种新途径。

rAPD -PCR in isolating a generic specific DNA probe for listeriaWang Xiaohui, Guo Zhaobiao, Zhang Minli, et al. Center for Detection and Research of Medical Microbiology, National Center of Biomedical Analysis, Institute of Microbiology and Epidemiology, Chinese Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071

【Abstract】ObjectiveTo develop a universal method to construct DNA probe specific for a given microorganism without any genetic background knowledge of the target species.MethodsChromosomal DNA of Listeria spp were amplified by RAPD-PCR. The product from L. monocytogenes was cloned into PGEM T-Vector and the cloned probes were labeled with ³²P by PCR and hybridized with genome DNA from different species of Listeriec and related bacteria other than Listeria.Resultsa 850-bp DNA probe was obtained with the specificity only for Listeria spp. ConclusionsRAPD-PCR method is of valuable in constructing DNA probe specific for microorganism intelested, avoiding the tedious procedure of constructing and screening of genome libraries as is required with previously described means of isolating such probes.

【Key words】ListeriaPolymorphism, random amplification DNADNA-Probe

常规的微生物诊断主要依据微生物的表型特征如培养特性、生化反应、抗原特性以及噬菌体分型等加以分析。但微生物表型的易变异性以及操作周期长等缺点促使人们从微生物遗传物质上寻找更可靠、快速的诊断方法。由此发展的DNA探针和聚合酶链反应(PCR)等核酸检测技术能较好地满足临床的需要^［1］，但上述方法建立的前提是对微生物遗传背景有清楚的了解。对未知微生物则需通过一种繁琐的构建、筛选靶基因文库过程来获得属、种特异探针。近年发展起来的不需了解生物遗传背景的基因分型方法如随机扩增DNA多态性(random amplification polymorphism DNA, RAPD)^［2］和限制酶切片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism, RFLP）^［3］为快速构建上述DNA探针提供了一种新的可能性，本研究以李斯特菌为试验模型，采用RAPD制备了李斯特菌属特异探针。

材料与方法

一、材料与方法

1.菌株来源与培养：李斯特菌标准株为本室保存，包括6个种即单核细胞增生李斯特菌(L. monocytogenes)、绵羊李斯特菌(L. ivanovii)、英偌克李斯特菌(L.innocua)、威尔李斯特菌(L.welshimeri)、西尔李斯特菌(L.seeliger)和默氏李斯特菌(L.murrayi)以及部分临床分离、鉴定的单核细胞增生李斯特菌。菌株在TSB-YE试管中37℃活化24小时，备用。非李斯特菌基因组DNA包括：金黄色葡萄球菌、志贺痢疾杆菌、牛布鲁杆菌、蜡样杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、粪链球菌DNA为本室保存。

2.菌株DNA提取： 按本室建立的载体吸附法快速提取收集菌株的DNA。取500 μl细菌培养液，用500 μl含SiO₂的裂解液室温作用15分钟，5 000 r/min离心1分钟，去上清液加500 μl洗涤液悬浮沉淀，随即5 000 r/min，离心2 分钟，彻底弃去上清液，加100 μl溶解液混匀沉淀，室温作用10分钟，5 000 r/min，离心2 分钟，上清液即为提取的李斯特菌基因组DNA，经紫外分光光度仪定量后保存于-20℃备用。

3.随机引物的筛选及RAPD方法的建立：长度为10 bp的系列随机引物为Operon公司产品，对引物的筛选和组合以便获得较复杂的李斯特菌指纹图，优化的随机引物组合：5′-GGGAGACATC-3′、5′-ACCAGTTTGG-3′、5′-GTGACGTAGG-3′、5′-CAATCGCCGT-3′、5′-TCGGCGATAG-3′、5′-TCTGTGCTGG-3′、5′-GACCGCTTGT-3′、5′-AGGTGACCGT-3′、5′-AGTCGTCCCC-3′、5′-GACGCCACAC-3′。

在25 μlPCR反应体系中含筛选的随机引物各1 μl(5 pmol/μl)、1U Taq DNA聚合酶(Promega公司)、10×PCR缓冲液(500 mmol/L KCl、100 mmol/L Tris-HCl)，pH8.3、 Mg²⁺25 mmol/L、DNA模板50 ng。94℃初始变性3分钟、94℃1分钟、35℃1分钟、72℃2分钟、共45个循环，最后于72℃延伸5分钟。

4.RAPD产物的克隆：将其中的一株单核细胞增生李斯特菌的RAPD扩增产物用常规的酚-氯仿抽提、无水乙醇沉淀法纯化，随后用Promega公司的T-载体（PGEM-T VECTOR）按试剂操作手册连接RAPD产物，受体菌JM109为本室保存。用CaCl₂法制备感受态，感受态的制备和连接产物的转化按分子克隆手册^［4］进行。对白色菌落先采用酚快速提质粒法初步鉴定，随后用载体两端的公用引物T7和SP6扩增阳性克隆以鉴定插入片段大小，最后用QIAGEN公司的Quick Plasmid Kit进行阳性克隆质粒的大量提取，提取的质粒定量后于-20℃保存备用。

5.探针的同位素标记：³²P标记的dCTP为北京亚辉生物公司产品，同位素采用PCR标记。操作同常规，只是用50 μci ³²P标记的dCTP 替换4×dNTP中的dCTP 。50 μl体系中含质粒10 ng、T7和SP6引物各10 μmol/L、4×dNTP/1 μl 2 mmol/L、1U Taq DNA聚合酶(promega)。扩增条件为94℃5分钟 ，55℃ 1分钟，72℃1分钟，35个循环后，72℃5分钟。

6.菌落原位杂交：将提取的李斯特菌和非李斯特菌基因组DNA各1 μg点膜于硝酸纤维滤膜上，菌落原位杂交按分子克隆手册^［4］进行： 滤膜在3 ml 6×SSC、5×Denhardt 、0.5%SDS 、100 mg/ml经变性并断裂成片的鲑精DNA预杂交液中于65℃预杂交2小时，随后加入标记的探针65℃过夜杂交。取出滤膜在 2×SSC，0.1%SDS中漂洗1次，每次30分钟，滤膜在室温晾干后于-70℃放射自显影，并通过KODA成像系统观察成像结果。

结果

1.通过引物的筛选、组合及对RAPD缓冲液中Mg²⁺浓度的优化，RAPD扩增李斯特菌产生条数在8～13、长度在100～1 500 bp的较复杂指纹图。

2.采用PGEM-T载体系统克隆单核细胞增生李斯特菌RAPD产物得到3个白色克隆，编号为A₁、A₂和A₃。菌落通过快速质粒提取证实有外源DNA片段插入，经T7和SP6引物扩增鉴定插入片段大小分别为A₁∶320 bp、A₂∶850 bp和A₃∶460 bp。

3.菌落原位杂交结果表明，A₁和A₃号DNA探针既能与李斯特菌杂交，也与部分非李斯特菌存在交叉反应（结果未显示）。只有A₂号探针可与全部李斯特菌株杂交，与其他非李斯特菌不反应 ，为李斯特菌属特异探针。同时我们还用上述制备的探针与临床分离、鉴定的单核细胞增生李斯特菌杂交，结果也为阳性，从另一个侧面证实制备的探针属特异性探针。

讨论

文献报道的微生物检测探针多根据已公开的基因序列设计，如李斯特菌的溶血素基因、侵袭性质粒基因以及IS重复序列^［5］。虽然近年来在基因库中收存的微生物基因数据日渐增多，甚至已测出个别细菌的全序列，但对遗传背景仍不甚清楚的众多微生物如何用核酸手段分析它们，是摆在微生物工作者面前的一个难题。常规的方法较繁琐，需要构建和筛选该微生物的基因文库。RAPD和RFLP等基因分型方法为我们提供了另一种简便、快速获得微生物基因组特异片段的新途径——从随机扩增或酶切得到的微生物DNA指纹图中寻找种、属特异探针。

我们采用RAPD成功克隆出李斯特菌属特异的DNA探针。这将为遗传背景不清楚的微生物基因探针的快速制备提供一种新的通用方法。此方法涉及三步骤：(1)RAPD扩增微生物基因组；(2)RAPD产物的克隆；(3)通过杂交进行探针的特异性鉴定。若有可能还可测序克隆探针，以便在上述基因序列上寻找特异的PCR引物。

由于细菌的基因组小且重复序列少，单一随机引物常不能产生复杂的指纹图来反映细菌特有基因组信息，从而使随后的种、属探针的制备失败。同时考虑不同随机引物对不同细菌基因组有不同扩增效率，有必要进行引物的筛选和组合^［6］。值得注意的是，随机引物的组合并不是越多得到的RAPD指纹图越复杂，且太复杂的指纹图也不便于下一步探针的制备，一般PCR指纹图在10～20条左右有利于结果的分析。RAPD扩增效率还与扩增体系中Mg²⁺浓度有密切关系，Mg²⁺浓度越高，扩增效率越高，但非特异扩增也随之加大。因此优化Mg²⁺浓度是必要的。Mg²⁺浓度一般在2～6 mmol/L。

Swamina等^［7］<