关键词： 细胞凋亡；脱氧核糖核酸酶类

【摘要】目的开发应用范围广，特异性、敏感性高的凋亡细胞检测技术。方法用末端脱氧核苷酸转移酶介导dUTP缺口末端标记法(TUNEL)和Klenow大片段介导的原位缺口翻译法(ISNT)检测了甲基泼尼松龙处理的SD大鼠胸腺组织，正常鼠肠粘膜组织、肿瘤组织等标本的石蜡组织切片，和体外培养的肿瘤细胞药物处理后发生凋亡的细胞爬片，以及再生障碍性贫血(再障)病人的骨髓涂片。结果在大鼠胸腺组织中可见大量凋亡的T淋巴细胞，鼠肠粘膜组织粘膜上皮细胞以凋亡的方式更新脱落，肿瘤组织中可见散在的凋亡细胞。药物处理的肿瘤细胞和再障病人骨髓细胞中有较多的凋亡细胞。被染成棕色或棕褐色的细胞在形态学上符合凋亡细胞的形态学改变。结论此两种方法可用于检测组织切片和培养细胞中的凋亡细胞，可以检测早期的细胞凋亡、并可通过计算标记指数对凋亡细胞进行定量或半定量，是不失于研究体内组织细胞凋亡的首选方法之一。

detection of apoptotic cells in tissue sections and cultural cells by tow in situ DNA fragmentation labeling techniquesTan Xiaohua, Zhou dianyuan, Jiang Bo, et al. Institute for Digestive Diseases,Nan Fang Hospital, First Medical University of pLA, Guangzhou 510515

【Abstract】ObjectiveTo use tow in situ DNA fragmentation labeling techniques to detect apoptotic cells in paraffin-embedded tissue sections and cultural cells.MethodsSpecimens of thymus tissue of SD rat treated with methylprednisone succinate, normal intestinal mucous tissue, tumor tissue in paraffin-embedded tissue sections and specimens of tumor cells treated with drugs and myeloid cells of aplastic anemia patients in cell smear were detected by terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end-labeling（TUNEL）and in situ nick translation（ISNT）. ResultsRat thymus tissue treated with methylprednisone succinate showed large amounts of apoptotic T lymphocyets. Epithelium of intestinal tissue dropped in form of apoptosis during metabolism. Scattered apoptotic cells observed in tumor tissue. There were many apoptotic cells in tumor cells treated with drugs and myeloid cells of aplastic anemia patients in cell smear. The cells stained by brown were consonant with changes of apoptotic cells in morphology. ConclusionsThe methods can detect apoptotic cells, especially early apoptotic cells, in paraffin-embedded tissue sections and cultural cells, and have quantity or semi-quantity of apoptotic cells by counting apoptotic index. The assay is one of preferred methods for apoptosis in vivo.

【Key words】ApoptosisDeoxyribonuclease

细胞凋亡（Apoptosis）或称程序性细胞死亡（PCD）是受基因控制的一种主动性细胞自杀过程，从形态学、生化和分子水平上与细胞坏死有明显的区别^［1］。胚胎形成、衰老和损伤的细胞的清除以及肿瘤的发生、发展和转归等病理生理过程都与细胞凋亡有密切的关系。如何准确、可靠地判断体内外细胞发生凋亡是细胞凋亡研究中必需的环节。细胞凋亡的生化特征之一，是Ca²⁺、Mg²⁺离子依赖的内源性核酸酶的激活将核染色体从核小体间裂断，形成由大约为180～200 bp或其多聚体组成的寡核苷酸片段^［2］，从而产生有游离3′-羟基末端的DNA断链。原位末端标记技术正是利用这一特征检测细胞凋亡的。

材料与方法

一、试剂及其配制

1.主要试剂：(1)Biotin-16-dUTP和dNTP（德国BM公司），(2)Klenow大片段(Promega公司)；(3)脱氧核苷酸末端转移酶（TdT酶，Promega公司）；(4)链霉抗生物素蛋白标记的辣根过氧化物酶(Streptavidin-HRP，美国ZYMED公司)；(5)胃蛋白酶(Serva公司)；(6)蛋白酶K(Sigma公司)；(7)二甲胂酸钠和巯基乙醇为日本产品；(8)二巯基苏糖醇（Gilbco公司）；(9)DAB（Sigma公司）。

2.试剂配制：（1）2×标准枸橼酸盐水(SSC)溶液：300 mmol/L氯化钠和30 mmol/L柠檬酸钠，pH 7.0；（2）内源酶阻断剂：1％H₂O₂-甲醇溶液或3% H₂O₂；（3）0.5%胃蛋白酶用HCl调至pH2.0，或蛋白酶K 10 μg/ml，以PBS配制；（4）Buffer A：50 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L MgCl₂，10 mmol/L β-巯基乙醇，0.005%牛血清白蛋白，pH 7.5；（5）ISNT标记液：0.005 mmol/L 三磷酸脱氧核苷(dNTP)，0.005 mmol/L Biotin-16-dUTP，25 U/ml Klenow大片段，用buffer A配制；（6）末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)缓冲液：100 mol/L二甲胂酸钠，0.1 mmol/L二巯基苏糖醇，1 mmol/L氯化钴，0.05 mg/ml牛血清白蛋白pH6.8；（7）TdT反应液：在TdT缓冲液中加入TdT酶100～200 U/ml，0.005 mmol/L biotin-dUTP；（8）DAB-H₂O₂显色液：DAB用0.1 mol/L Tris-HCl配成0.4%储存液，-20℃避光保存。用前用0.1 mol/L Tris-HCl稀释10倍，加3%H₂O₂，终浓度为0.001%。

二、标本制备

1.细胞爬片：6孔板中放置盖玻片，人大肠癌LoVo细胞在上面生长。用RPMI-1640(Gibco) 培养液(内含15%小牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/ml的青链霉素)置5%CO₂孵箱中培养。生长至对数生长期，加儿茶素（0.5 mg/ml）继续培养24小时，取出磷酸盐缓冲液PBS洗1次，4%的多聚甲醛固定5～10分钟，PBS洗1次，用无水乙醇∶乙酸（2∶1）在-20℃固定10分钟。

2.再生障碍性贫血病人骨髓涂片。

3.SD大鼠（4周龄）腹腔内注射甲基泼尼松龙(5 mg/kg)^［3］，于0、4、6小时取出胸腺，4%甲醛固定，常规石蜡包埋、切片；取正常SD大鼠的肠粘膜组织处理同上。

4.活检肠癌组织标本，用4%甲醛固定，常规石蜡包埋、切片。病理诊断为低分化腺癌。

三、TdT介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）

1.组织切片染色过程：（1）切片常规脱蜡，复水后后续过程在湿盒内进行；（2）以3％的H₂O₂阻断内源性辣根过氧化物酶10分钟；（3）以PBS洗2次，每次5分钟；（4）切片浸泡在2×SSC 80℃，20分钟；（5） PBS洗2次，每次5分钟；（6） 蛋白酶K或胃蛋白酶消化5～15分钟；（7）PBS洗2次，每次5分钟；（8） TdT缓冲液孵育10分钟；（9） TdT反应液37℃孵育1小时；（10）切片浸泡在2×SSC溶液10分钟，以终止反应；（11）PBS洗2次，每次5分钟；（12）链霉抗生物素蛋白标记的辣根过氧化物酶孵育30分钟；（13）PBS洗2次，每次5分钟；（14）DAB显色5～10分钟，镜下控制时间；（15）苏木素复染3～5分钟，常规复水、透明和封片。

2.细胞爬片或涂片染色过程：省去第1步和第4步，其余步骤同上。

四、Klenow大片段介导的原位缺口翻译（ISNT）

1.组织切片染色过程：按参考文献［4］介绍的方法进行。

2.细胞爬片或涂片染色过程基本同TUNEL。

五、阳性细胞标记指数的计算：被TUNEL染成棕色或棕褐色的细胞为凋亡细胞，低倍镜下随机数5个视野，每个视野数100个细胞，计算凋亡细胞所占的比例，求出5个视野的平均值即为凋亡细胞的标记指数。

结果

1.石蜡组织切片原位末端标记结果：甲基泼尼松龙大鼠腹腔内注射可诱导体内胸腺、脾脏组织等的淋巴细胞发生凋亡，用TUNEL方法和ISNT方法均检测出凋亡的淋巴细胞，凋亡细胞显棕色或棕褐色着染。在注射甲基泼尼松龙之前，胸腺、脾脏组织中可见散点状的凋亡细胞；注射甲基泼尼松龙4小时和6小时后，凋亡的淋巴细胞明显增多，显局灶状或片状(图1)，显现动态变化。肠粘膜上皮组织是更新很快的组织，粘膜基底层的细胞不断地分裂增殖，而粘膜上皮细胞不断地以凋亡的方式脱落，两者维持着肠粘膜细胞数的动态平衡，用原位末端标记技术可检测到发生凋亡的脱落肠粘膜上皮细胞(图2)。在活检肠癌组织切片，可见标记的凋亡细胞显散点状分布(图3)。用TUNEL方法检测组织切片中的凋亡细胞似乎比ISNT方法的信号更强，背景更清晰。

2.细胞爬片或涂片原位末端标记结果：用儿茶素（0.5 mg/ml）处理大肠癌LoVo细胞可诱导其凋亡，琼脂糖凝胶电泳可见典型的“梯状”带(图4)，用TUNEL方法或ISNT方法检测儿茶素处理24小时的细胞爬片，可见棕色或棕褐色着染的凋亡细胞，被标上棕色或棕褐色的细胞显典型的凋亡细胞形态学改变，变小变圆，固缩；而相对正常的细胞显梭形，细胞核显蓝色着染(图5)；处理12小时和24小时TUNEL阳性细胞标记指数分别为28%和46%。再生障碍性贫血病人骨髓涂片被标记成棕色的凋亡细胞在高倍镜下，细胞核显典型的核碎裂、核固缩表现(图6)。

讨论

原位DNA断链标记技术称为原位末端标记技术，是利用细胞凋亡时产生寡核苷酸片段，暴露出游离3′-羟基末端的特征，将外源性核<