关键词： 分枝杆菌；结核；聚合酶链反应；酶联免疫吸附测定

【摘要】目的建立结核分枝杆菌的PCR-酶联免疫吸附测定(ELISA)方法，使PCR结果判定更加客观。方法我们使用玻璃粉吸附提纯模板DNA，将PCR引物5′端标记生物素，用PCR产物与微孔板中预先包被的克隆靶基因杂交，然后用酶标链霉亲和素与杂交体中的生物素结合，最后用酶底物与所标记酶进行显色反应，通过测定其吸光度来判断结果。结果所建立的PCR-ELISA检测法可提高检测的灵敏度和特异性。对50份来自结核病人高度怀疑有结核分枝杆菌的标本检测表明，PCR-ELISA检出22份阳性，比抗酸染色法(7/50)、培养法(13/50)和PCR-电泳法(18/50)检出率高，而20份证实无结核分枝杆菌的标本，几种方法检查均为阴性。结论该法可敏感、特异和客观地检测临床标本中的结核分枝杆菌。

detection of mycobacterium tuberculosis by using polymerase chain reaction and microwell plate hybridizationYang Zhenglin^*, Yang ruifu, Du Qiong, Guo Zhaobiao, Zhang Minli, Wang Xiaohui, Yang Mingqing ^*Clinical Laboratory, Sichuan People′s Hospital, Chengdu 610072, Sichuan Province

【Abstract】ObjectiveTo develop a PCR-ELISA method for objective detection of Mycobacterium tuberculosis from clinical specimens;MethodsDNA template purified by using silicon-absorption method was amplified by the specific primers labeled with biotin at 5′end. PCR products were detected by hybridization with capture probes precoated onto the Maxisorp microplate and the hybrids were visualized by colorimetry; Results PCR-ELISA method developed by us could detect target bacteria with higher sensitivity and specificity comparing with the conventional PCR-electrophoresis methods. 50 sputum specimens which maybe contain Mycobacterium tuberculosis were used to evaluate the method. The results demonstrated that 22 of 50 were positive by PCR-ELISA method while only 7/50 and 18/50 by antiacid staining and culture respectively, and no positive result was found in 20 sputum specimens without Mycobacterium tuberculosis by the methods; ConclusionThe pCR-ELISA method can objectively detect Mycobacterium tuberculosis from clinical specimens with high specificity and sensitivity.

【Key words】Mycobacterium tuberculosisPolymerase chain reactionEnzyme-linked immunosorbert assay

从80年代中期以来，全球结核病患者人数呈上升趋势。自1989年聚合酶链反应(PCR)用于结核分枝杆菌检测以来，该技术已广泛应用于结核病的诊断，并已显示出很多优点。但在临床应用时，此技术还是遇到了很多问题，比如灵敏度和特异性问题，污染问题，因为存在Taq DNA聚合酶抑制物质而致假阴性结果^［1，2］。虽然可以通过斑点杂交，Southern杂交法提高PCR的灵敏度和特异性，但是，这些方法复杂，又不适合用于大量标本的检测，故其不适合于临床应用；另外，套式PCR可以提高特异性，但增加了污染的危险^［1］。在参考国外现有文献的基础上，我们建立了结核分枝杆菌的PCR-微孔板杂交检测法，报告如下。

材料和方法

材料和方法

一、菌株

本实验所用菌株均经常规鉴定，分枝杆菌属内不同种菌株(包括脓肿分枝杆菌、鸟分枝杆菌、牛分枝杆菌、胃分枝杆菌、戈登分枝杆菌、微黄分枝杆菌、胞内分枝杆菌、偶发分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、无色分枝杆菌、瘰疠分枝杆菌、猿分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、结核分枝杆菌、蟾分枝杆菌)的DNA由日本歧阜大学江崎孝行教授惠赠，其他菌株(包括嗜肺军团杆菌、肺炎支原体、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌)由军事医学科学院微生物流行病研究所保存，结核分枝杆菌临床分离株来自成都市结核病医院。

二、标本处理

采用裂解液裂解，玻璃粉吸附法提取菌株及标本中的DNA，痰标本采用NaOH液化^［4］。

三、PCR引物的设计

以结核分枝杆菌IS6110插入序列为靶序列，用SEQNCE，PRIMERS，PCRDESN和OLIGO等软件设计了一对各20 mer的引物，引物1为5′GCT GTG GGT AGC AGA CCT AT3′，引物2为5′TAC TGG TAG AGG CGG CGA TT3′，扩增一443 bp的DNA片段，引物5′端修饰Bio-ll-dUTP，引物由美国赛百盛公司合成。

四、PCR条件(特异性和灵敏度)

PCR条件：30 μl反应体系中含10 mmol/L Tri-HCl(pH8.4)，50 mmol/L KCl，2.0 mmol/L MgCl₂，0.01%明胶，200 μm各dNTP。两条引物浓度各为100 pmol/L，1U TaqDNA聚合酶(dNTP和TaqDNA聚合酶购自Promega公司)。加入27 μl标本提取液。在PTC51B热循环仪(军事医学科学院产)上进行扩增，循环参数为94℃变性3分钟，94℃40秒，58℃40秒，72℃40秒，20次循环后，72℃延伸5分钟。

特异性试验：将与结核分枝杆菌缘距较近的细菌与结核分枝杆菌进行同样扩增，杂交，显色。

灵敏度试验：将结核分枝杆菌标准株(H37Rv)所提模板DNA定量后，进行对倍稀释，分别进行同条件的PCR扩增，电泳，杂交，显色。

五、包被探针的克隆

用未标记引物行PCR扩增获得特异片段，用QiAgen PCR产物纯化试剂盒纯化产物，与T-载体(Promega T-vector)连接过夜后(按试剂盒说明书操作)，转化用CaCl₂制备的感受态大肠杆菌JM109，用含X-gal和IPTG的青霉素平板以蓝白菌落为标志，挑选含插入片段的白色菌落，用质粒提取和PCR来鉴定重组子^［5］。

六、微孔板杂交

包被：用QiAgen Plasmid purification kit从重组子中提取质粒，定量后，用包被液PBS-Mg²⁺分别配成10，7，5，3 μg/ml浓度，热变性后，每孔以100 μl包被NUNC Maxisorp单条可拆微孔板，4℃过夜，次日以漂洗液(PBS-0.1% Tween 20)洗3次，45℃干燥待用^［6］。

预杂交：加预杂交液(5×SSC，5×Denhardt′s，50 μg/ml鲑鱼精DNA，10%硫酸葡聚糖)200 μl于包被的微孔板中，50℃预杂交1小时。PCR产物的获得：待检菌株或标本DNA经5′端修饰生物素引物行PCR扩增，循环次数分别设定为10，15，20，25，30，35次，PCR产物经100℃5分钟变性，立即冰浴10分钟使成单链，分别将单链PCR产物20 μl加入预杂交液100 μl中。杂交：将上述含变性产物的预杂交液100 μl加入预杂交的微孔中，50℃杂交，时间分别设定10，15，30，90，120，180，240分钟。漂洗：弃去杂交液，用2×SSC洗4次，0.5×SSC洗2次，或用PBS-0.1%TWEEN20洗5次。

显色：加或不加入封闭液(PBS-0.1% Tween，5%BSA)封闭1小时后，漂洗液洗5次，加碱性磷酸酶标记的链霉亲和素100 μl(Promega公司)，稀释度分别为1∶200(终浓度为10 μg/ml)，1∶400(终浓度为5 μg/ml)，1∶800(终浓度为2.5 μg/ml)，1∶1 200(终浓度为1.67 μg/ml)，1∶1 600(终浓度为1.25 μg/ml)，1∶2 000(终浓度为1.0 μg/ml)。37℃作用10，15，20，30，60分钟，漂洗液洗5次后，加入浓度分别为0.1，0.2，0.4，0.8和1.0 mg/ml的底物PNPP，作用15，30，90，120，240分钟后，加入终止液(2M NaOH)，于405 nm测定吸光度(A)值，判断结果^［7，8］。

七、初步应用

取来自结核病患者的高度怀疑有结核分枝杆菌的痰标本50份，非结核病患者痰标本20份，分别进行抗酸染色，培养(Bactec)，PCR扩增电泳和PCR-ELISA检测比较。

结果

1.PCR的特异性：在特异性试验中，本方法除结核分枝杆菌结果显示阳性外，亲缘关系较近的其他细菌均为阴性。

2.PCR的灵敏性：灵敏度试验显示该方法能检出5.0 fg的结核分枝杆菌DNA，而PCR电泳法的灵敏度只有50 fg DNA，即前者的灵敏度是后者的10倍。

3.微孔板杂交体系的优化：在杂交体系优化实验中，显示出重组子提取的质粒包被量越大，结果所测A值越高，但包被量在5 μg/ml以上时，增加不太明显，杂交时间延长，其A值也逐渐增加，但在杂交1小时后，增加量显著降低；酶标链霉亲和素的稀释度在1∶1 200(终浓度为1.67 μg/ml)以下无变化，在1∶1 600(终浓度为1.25 μg/ml)时变化也不超过0.1；其与生物素作用时间在15分钟以后，对结果影响不大，从PCR循环次数的比较可看出，20次以后，其A值增加甚少；底物PNPP浓度高时，显色快，A值也高，但同时其空白对照背景也增加，底物与酶作用时间在2小时后，结果显示已较明显。取消封闭步聚对实验结果无影响；杂交后用SSC洗涤和用PBS-0.1% Tween20洗涤效果一样。综合考虑后，杂交体系定为：以5 μg/ml重组质粒用PBS-Mg²⁺包被微孔板，4℃过夜，次日弃去包被液，用洗液(PBS-0.1% Tween20)洗3次，45℃干燥备用，用5′端修饰生物素引物扩增产物经热变性<