关键词： 急性淋巴细胞白血病；突变；DNA重复顺序；p16基因

【摘要】目的探讨p16基因突变在白血病发生中的作用及基因突变的机制。方法利用点突变检测仪、水平和垂直板电泳对p16基因的外显子1、外显子2的PCR扩增产物作缺失和点突变分析。结果在白血病35例临床标本中有22例发生缺失突变，6例发生点突变，突变率约80%。在22例缺失突变病例中，有10例为不完全缺失突变即有低于外显子509 bp的扩增产物。结论p16基因含有“GC”DNA重复顺序，易发生DNA重组及易位和重排。在白血病发生中起重要作用

Mutation analysis of p16 gene in acute lymphoblastic leukemiasYe Feng, Wang jianxun. Department of Centre Laboratary, First Affiliated Hospital, Guangdong Medical College, Zhangjiang 524001

【Abstract】ObjectiveTo analyze the role of p16 gene mutation in acute lymphoblastic leukemia genesis and mechanism of p16 gene mutation.MethodThe exon2 and exonl of p16 gene was amplified by polymerase chain reaction respectively. The products were analyzed by CDGE (constant denatured gel electrophoresis in Dcode^TM apparatus) and 1.8% agarose gel separately.ResultsWe had 22 deletion mutational cases and 6 point mutations from 35 clinical specimens. The mutation rate was about 80% and 10 of the 22 deletion mutations were uncomplete deletion mutations, which had two amplified DNA bands less 509 bp (ladder bands).ConclusionsMutation of p16 gene has played an important role in acute lymphoblastic leukemia genesis. Becaucse its exons own "CG" DNA repetitive sequence, p16 gene is apt to lose part of the sequence leading to mutation. So the mechanism of the mutation is that recombination and rearragement of the "CG" repetitive sequence lead to uncomplete DNA deletion. It is why the rate of deletion mutation is higher than that of point mutation.

【Key words】Acute lymphoblastic leukemiaMutationDNA repetitive sequencep16 gene

p16基因是一种抑癌基因^［1，2］，已被定位于9p21的位置上。Serrano等^［3］人表明p16/CDKN2/INK4基因是一个细胞周期相关的基因，其编码的蛋白质可与细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)结合，并抑制其活性。CDKs的活性是调节正常细胞生长的关键激酶。p16基因的突变将会导致细胞无控制的生长和癌症的产生。已有很多报道认为在多种恶性肿瘤如肺癌、宫颈癌、胃癌等的组织中p16基因发生多种遗传变异。

作者利用白血病病人临床标本对p16基因外显子1、外显子2进行缺失突变和点突变分析研究，发现白血病细胞p16基因缺失突变率异常高，其原因是因为基因外显子具有丰富“CG”DNA重复顺序。

材料和方法

一、材料

1.标本收集：白血病细胞标本均来自本院儿科共35例。病人经过骨髓穿刺确诊为急性白血病。

2.主要试剂和仪器及来源：Taq酶、饱和酚、琼脂糖、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、TEMED、过硫酸铵、尿素等购自GibcoBRL公司；蛋白酶K、SDS购自Sigma公司；点突变检测仪、水平和重直板电泳槽、电泳仪、成像系统(Image System Gel DC 1000)购自Bio-rad公司；高速低温离心机购自Beckman公司；PCR扩增仪购自Thermolyne公司。

二、方法

1.DNA的抽提：用一般经典方法酚-氯仿抽提法，即在用分离液分离出淋巴细胞之后，高速离心，15 000 r/min收集淋巴细胞，用SDS、蛋白酶K在56℃条件下消化3小时，再分别用酚、酚：氯仿、氯仿各抽提一次，用2倍无水乙醇沉淀。最后干燥DNA，用TE溶解保存，紫外测吸光度(A)。

2.PCR扩增和缺失分析：PCR扩增引物按文献设计^［1，4］，由北京赛百盛公司合成：外显子1(343 bp)，P1为5-GAAAGGAGAGGAGGGGCT-3′，P2为5′-GCGCTACCTGATTCCAATTC-3′和外显子2(509 bp)P3为5′-GGAAATTGGAAACTGGAAGC-3′和P4为5′-TCTGAGCTTTGGAAGCTCT-3′。扩增条件：1 μM引物，200 μM dNTPs，2U Taq聚合酶，200 ng DNA模板，3 μl 10×扩增缓冲液，反应体积为30 μl在94℃45秒，51℃45秒，72℃50秒条件下共35个循环。PCR产物在1.8%琼脂糖凝胶电泳90分钟，溴化乙锭染色20分钟，在成像系统中拍照。

3.点突变分析：利用Bio-Rad公司生产的单碱基突变检测系统(Dcode^TM)对PCR扩增产物作均一变性凝胶电泳(CDGE，constant denatured gel electrophoresis)分析。即在10%PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)中加入尿素，使其到达51%的变性度。电泳缓冲液为1×TAE，在56℃条件，用130伏电压，电泳3小时。然后溴化乙锭染液浸泡20分钟，取凝胶置于成像系统(Image system DC 1000)中摄影拍照。在DNA分子量大小一致的情况下，如果是野生型DNA带，则走在前面，若是点突变型带则滞后落在后面，若既有突变型又有野生型的DNA带，则分开为两条带。

结果

1.p16基因的缺失：利用设计好的引物分别扩增外显子1(343 bp)和外显子2(509 bp)^［1，4］，在35例标本中，外显子2发生缺失突变的有20例即没有扩增带509 bp。其中有10例病人的扩增带低于400 bp大小，且有2条扩增带，说明外显子2的基因缺失是逐步缺失，另10例病人的外显子是完全纯合缺失。只有一例为杂合缺失(见图1)。外显子1的缺失较少，只有8例发生缺失突变(见图2)。其中一个标本的外显子1为正常扩增带，而外显子2为缺失突变，其他标本外显子1发生异常的，外显子2同样发生异常。

m：DNA低分子量标记；1：阴性对照；2：野生型对照；4、9、10：野生型；5、6、7、8、11、12、14：未完全缺失突变；3、13：完全缺失突变

图1p16基因外显子2缺失突变分析

m：DNA低分子量标记；3、4、6、7、8、9、10、11、12：野生型；1、2、5、13、14：缺失突变

图2p16基因外显子1缺失突变分析

2.p16基因的点突变：为了确定p16基因的点突变是否存在，用CDGE技术来检测同样批标本的PCR扩增产物。如果发生点突变，既便分子量大小一样，野生型DNA带在电泳中走得快，而突变型带在电泳胶中走得慢，因而可分区出哪一个标本中含有点突变的带。对具有509 bp左右片段大小的外显子2扩增产物经CDGE电泳分离，5例未见有点突变，发现6例具有点突变的带，其中1例是纯合突变。5例是杂合突变(见图3)。由此可见35例标本中，有28例发生了突变，突变率为80%。

1、2、11、12：野生型；3、4、5、6、13：杂合突变；7：纯合点突变；8、9、10：无结果

图3p16基因外显子2点突变分析

讨论

已有很多的肿瘤抑制基因的点突变或缺失突变导致基因产物的失活而引起癌症的原因如p53、RB等抑制基因。Toshki等^［4］对白血病p16基因的DNA进行序列分析发现Southern杂交的反常带中有13 bp和35 bp片段的缺失。而在我们的外显子2扩增产物中发现DNA的缺失是呈梯度进行的，即逐一段一段缺失的，所以我们推测p16基因外显子2基因序列为活跃区，可能为重复序列。在对缺失序列^［4］的分析后发现缺失基因大多为“CGC”或“CGG”序列重复。所以p16基因外显子2内这段“GC”重复顺序非常活跃，导致了基因缺失频繁，而且缺失长度不等。从细胞遗传学研究中证实^［5，6］9 p位置缺失突变率在38%～88%之间，而p16基因恰好位于此多变异区内。

已经有报道^［7］p16基因具有很高的纯合缺失突变率而其点突变则较少，Toshiki等^［4］从52例标本中只发现3个点突变。本次实验发现p16基因的突变率非常高，纯合缺失突变35例中有20例，突变率为56.1%，杂合缺失突变35例中只有1例约3%，点突变35例有6例，约17%，总突变率约达80%左右。我们的结果与Dreyling报道^［8］相类似。但Liu等^［9］通过SSCP和Southern分析，在37例乳腺癌中未发现p16基因的变异，这意味着CDKN2/p16突变对乳腺癌的发生并不起关键作用。所以p16基因是否在所有癌症发生中占重要作用应进一步用实验来证明。J.Q.C认为p16基因的非编码区内的突变、重组和下游调控在基因失活中占有重要作用。根据我们实验结果，p16基因在白血病发生中占有相当重要作用，尤其是外显子的重复序列区处于高度活跃状态，易发生重组，具有不断丢失其DNA序列的倾向，这也是缺失突变率远远大于其点突变率的原因。

参考文献

1Kamb A, Gruis NA,