人类HCMV感染非常普遍，在成人可达80%～96.74%^［1］，而只有活动性感染才可导致病理性损害。因此建立一个快速、准确、敏感的HCMV活动性感染的检测方法，对HCMV感染的诊断和治疗具有重要意义。我们采用逆转录PCR(RT-PCR)方法，通过检测HCMV晚期基因的转录产物-mRNA，初步建立了一个HCMV活动性感染的检测方法，报道如下。

一、对象和方法

1.细胞培养及病毒感染：人胚肺成纤维细胞(HEL)和HCMV AD169标准毒株均来源于本院儿科病毒室，按常规方法培养传代、滴定。待第22代HEL细胞长成单层后，以100TCID₅₀AD169感染HEL细胞，吸附1.5小时后换维持液，分别于感染后6、12、24、48、72、96小时中止培养。

2.HCMV活动性感染患者的筛查：采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法筛选 出HCMV-IgM阳性育龄妇女8例和孕妇42例，年龄22～34岁，平均26岁。

3.培养细胞及外周血细胞RNA的提取：参照胡冬贵等^［2］的方法。

4.RT-PCR 引物设计：参照Gozlan等^［3］的报道，两条引物的序列为5′GTGATCCGACTGGGCGAAAA 3′和5′ GA-GCGCGTCCACAAAGTCTA 3′，基因位置分别为1198～1217和1461～1442，扩增片段为263 bp，由上海生工生物工程公司合成。RT-PCR按试剂盒使用说明书进行。反应条件为：48℃逆转录45分钟；94℃灭活及预变性2分钟；再经94℃ 30秒，60℃ 60秒，68℃ 120秒，反应40个循环；68℃延伸7分钟。取反应产物10 μl在2%琼脂糖凝胶上电泳40分钟，紫外灯下观察、照相。

二、结果

1.RNA的完整性及纯度：我们所提取的RNA在2%琼脂糖凝胶上电泳呈典型的三条带，表明RNA的完整性较好，经RNA/DNA测量仪检测，浓度为30～50 μg/ml，纯度：88%～98%，吸光度A 260/280 nm：1.618～1.881。

2.RT-PCR的结果：HEL细胞在AD169感染12小时后即可检出HCMV晚期mRNA，48小时开始出现细胞病变，96小时细胞病变达+++。50例IgM阳性育龄妇女和孕妇检出晚期mRNA29例。

为证实本试验的结果，我们分别不经逆转录直接进行PCR，以及在RNA提取物中加入RNase处理后再进行PCR检测，结果均未扩增出设计片段，表明本组所提取的RNA不仅完整，而且无基因组DNA的污染，扩增阳性片段为mRNA逆转录的产物。

3.RT-PCR的特异性和敏感性：我们所扩增出的阳性片段为263 bp，与设计扩增片段长度一致，两例临床分离的HCMV野生株扩增结果为阳性，而正常HEL细胞及HSV-Ⅰ Sm₄₄和HSV-Ⅱ₃₃₃株均未扩增出阳性片段。经对扩增模板RNA进行10倍梯度稀释后进行PCR检测，显示10 fg模板RNA仍可扩增出阳性片段。

三、讨论

1.RNA的完整性和纯度在试验中的重要性：RT-PCR的关键所在就是模板RNA的完整性，因此试验中应尽可能减少RNA的降解，要求标本新鲜，试剂均用DEPC处理水配制，所用器皿也须用DEPC水处理，高压烘烤或高压消毒。

由于HCMV晚期基因为连续基因没有内含子，设计引物扩增的结果既可能来自cDNA，也可能来自样本中污染的基因组DNA，因此试验要求模板RNA具有较高的纯度。我们所提取的RNA纯度为88～98%，A260/280在1.618以上，通过在对照实验中不经逆转录直接进行PCR和在模板中加入RNase处理后再进行PCR，进一步证明本组所提取的RNA不仅完整性好，而且纯度高，无基因组DNA的污染，可以满足RT-PCR的要求。

2.RT-PCR在检测HCMV感染中的意义：HCMV晚期基因的转录产物mRNA直接翻译病毒的结构蛋白，不仅与病毒基因组的复制有关，而且是具有完整病毒循环的标志，因而被认为是HCMV活动性感染最可靠的指标。Gozlan等^［4］的报道显示在感染细胞中加入病毒抑制剂丙氧鸟苷或三磷甲酸后，HCMV晚期mRNA的表达受到显著抑制，表明HCMV只有在活动状态下才能表达晚期mRNA。临床应用的结果也证明其诊断价值优于PCR和即刻早期抗原^［3］。

我们采用RT-PCR法检测HCMV晚期mRNA的表达，初步建立了一个HCMV活动性感染的检测方法，并成功地检测出临床分离病毒株和HCMV活动性感染患者，实验步骤简便、耗时少、敏感性强、有较高的特异性，具有推广应用价值。

本研究为国家九五重点攻关课题

参考文献

1闻良珍，吴圣楣，吕绳敏，等.三城市孕妇人巨细胞病毒感染及其母婴传播的流行病学调查.中华妇产科杂志，1996，31：714-717.

2胡冬贵，黎青，华小云，等.真核细胞质总RNA快速提取和鉴定技术的改进.中华遗传学杂志，1996，13：179-180.

3Cozlan J, Salord JM, Chouaid C, et al. Human cytomegalovirus (HCMV) late-mRNA detection in peripheral blood of AIDS patients: diagnostic value for HCMV disease compared with those of viral culture and HCMV DNA detection. J Clin Microbiol, 1993, 31:1943-1945.

4Gozlan J, Caburet F, Tancrede C, et al. A reverse polymerase chain reaction method for detection of human cytomegalovirus late transcripts in cells infected in Vitro. J Virol Methods, 1992, 40:1-10.

(收稿：1997-12-27修回：1998-04-12)