聚合酶链反应(PCR)技术诞生后不久即用于RNA的扩增^［1］。这种方法需要首先将RNA逆转录(RT)为cDNA链后再进行常规PCR扩增，程序较繁琐，且需逆转录酶及RNA酶抑制剂等成本较高试剂。有研究表明Taq聚合酶及Tth DNA聚合酶有逆转录功能，且已成功地用于逆转录RNA，使RT-PCR一次完成^［2］。HEK5是酪氨酸蛋白激酶受体EPH亚类一新基因，在胃癌中呈高表达，推测在肿瘤发生、胚胎发展控制中起重要作用，为进一步研究其基因结构、功能、基因表达情况及其肿瘤发生机制，我们设计并合成引物，采用Tth DNA聚合酶， 建立了一种更为简单的一步RT-PCR方法，从组织标本及培养的人肿瘤细胞中成功地扩增出特异性好、敏感的HEK5胞外配体结合区基因片段。

一、材料和方法

1.模板提取：将胃癌手术中切下的癌组织标本剪成约20～40 mg，冻于-70℃，用时迅速剪成碎块投入预先加好冰冷盐酸胍变性液的玻璃匀浆器中彻底匀浆，按Chomczynshi等一步法提取总RNA，定量。体外培养的人肿瘤细胞经消化、计数，取约1×10⁶细胞沉淀以PBS洗一次，然后加入100 μl变性液，提取RNA(方法同前)。

2.PCR引物：参照HEK5全长cDNA序列设计引物P1：5′ TCGGCCACCAAAA-GCTTCCC; P2：5′ CCATTCTGGATGATGC-GC;P3：5′ GGCCTCGGATCCTGCTTTGCA。P1、P3扩增片段长为423 bp，P1、P2以423 bp为模板进行巢式PCR，扩增片段长248 bp，内参照β-actin引物Ⅰ：5′ CACTGTGTTGGCGTACAGGT;Ⅱ：5′ TCATCACCATTGGCAATGAG，从RNA模板扩增的产物长154 bp，从DNA模板扩增产物长250 bp。

3.PCR反应：取经测定吸光度(A)260/280比值达2.0左右的总RNA约1 μg，梯度稀释后分别加入 RT-PCR扩增液(1×PCR Buffer，dNTP150 μm，各引物0.1 μmol，Mg²⁺ 1.5 mmol，Tth DNA聚合酶1 U，Tth DNA聚合酶由全军基因诊断技术应用研究所提供)至总体积25 μl，覆液体石蜡油30 μl，65℃逆转录15分钟，然后进行35次PCR反应：94℃30秒，58℃35秒，72℃45秒，最后72℃延伸5分钟。PCR产物电泳EB染色后，紫外透射分析仪上观察结果，或经银染直接观察。

4.PCR产物鉴定：PCR产物经2.5倍体积无水乙醇沉淀回收后用SmaⅠ酶切鉴定，及用巢式PCR扩增内引物片段。

二、结果和讨论

1.以该法与经典RT-PCR法进行了对比扩增，结果RNA分两步经AMV逆转录为cDNA后再用Taq酶进行PCR，与只用Tth DNA聚合酶一步同时进行逆转录与PCR在扩增上效果一致，均能扩增出较好产物带，无非特异产物出现。在所扩增的10株肿瘤细胞株中两种方法阳性率一致，扩增阳性与阴性标本均同时扩增出内参照β-actin 154 bp RNA产物带，表明RNA的提取及逆转录PCR是成功的，而根据目的片段423 bp的有无则可对PCR扩增做判断。

2.在组织标本的扩增中，我们从1 μg总RNA稀释至7 ng进行一步法扩增，得到目的片段。经改进反应体系补加Mn⁺，银染观察少至100 pg总RNA仍可检测到，略低于文献报道（可检出80 pg RNA）^［3］。用限制性内切酶分析Tth与Taq DNA聚合酶的扩增产物，均能被SmaⅠ消化并产生与预期大小相吻合的特异性片段；经巢式PCR均能扩增出248bp特异带，证实了PCR产物特异性。

3.与经典RT-PCR扩增操作较多，时间长，试剂贵相比，用Tth DNA聚合酶一步扩增RNA可使逆转录在较高温度下进行，减少了错误的引物启动，增加了引物延伸的特异性，降低了RNA模板中存在的稳定二级结构对逆转录的影响，免除了在RT反应及PCR之间缓冲液的转换，通过简便的一次操作，缩短反应时间，尤其在定量诊断时能减低污染的危险，降低了试管间各成份的反应差异，增加了结果的可靠性。在检测、定量及克隆细胞与病毒RNA方面有着重要的实用价值。

参考文献

1Powell LM,Wallis SC,Pease RJ, et al.A novel form of tissue-specific RNA processing produces apolipoprotein-B48 in intestine. Cell, 1987, 50：831-840.

2Ruttimann C,Cotorás M,Zaldívar J, et al. DNA polymerases from the extremely thermophilic bacterium Thermus thermophilus HB-8. Eur J Biochem, 1985,149：41-46.

3Myers TW,Gelfand DH. Reverse transcription and DNA amplification by a Thermus thermophilus DNA polymerase. Biochemistry, 1991,30：7661-7666.

(收稿：1997-07-25修回：1998-01-04)