关键词： 嗜血杆菌属；培养基

【摘要】目的建立一种简便、有效的分离嗜血杆菌的方法。方法利用万古霉素-杆菌肽-氯林可霉素巧克力法(VBC法)、血平板纸片法和传统巧克力法，对含正常菌群的标本进行嗜血杆菌的分离。结果巧克力平板上流感嗜血杆菌生长佳，但正常菌群影响嗜血杆菌分离，对100份模拟痰标本分离情况进行比较，结果VBC法、纸片法及巧克力法的分离率分别为76%、84%和64%，进行配对卡方检验，巧克力法与VBC法和纸片法的P值均小于0.01，其结果差异有显著性；对241份临床痰标本进行VBC法和纸片法分离，流感嗜血杆菌分离率分别为4.3%和4.98%，进行卡方检验,P＞0.05，两法结果无差异。结论血平板上纸片分离嗜血杆菌的方法简便、实用、效果较好，初次分离时可观察卫星现象和溶血情况，有应用推广价值。

A novel method for isolating haemophilus species on blood agarTang Mingzhong, Liu Juan, Wang Meirong, et al. Department of Laboratory Medicine, Tian Tan Hospital, Beijing 100050

【Abstract】ObjectiveTo establish a simple and effective method for isolation of Haemophilus species.MethodsHaemophilus species from specimens contaminated by microbial flora were isolated with a strip method on blood agar, a conventional chocolate agar method, and a chocolate agar with vancomycin, bacitracin and clidamycin(CHOC-VBC) method.ResultsHaemophilus influenzae grew well on the conventional chocolate agar. But microbial flora had influence on the growth of Haemophilus species. According to the result of 100 simulative sputum specimens isolation, the recovery rates of H.influenzae with CHOC-VBC, the strip method on blood agar, and chocolate agar were 76%,84%, and 64% respectively. The recovery rate of H. influenzae with chocolate agar was significantly lower than that with the strip method and CHOC-VBC (P＜0.01). H. influenzae were isolated from 241 clinical sputum specimens by CHOC-VBC and the strip method. The rates of recovery were 4.3% and 4.98% respectively. The two methods showed no significant difference (P＞0.05).ConclusionThe strip method to isolate Haemophilus spp. on blood agar is effective and simple. The satellite phenomenon and hemolysis can be observed during the primary isolation.

【Key words】HaemophilusCulture media

流感嗜血杆菌是引起上下呼吸道感染的常见细菌。但嗜血杆菌分离培养较困难，欲提高嗜血杆菌的分离率，在巧克力琼脂中需加入氯化血红素、维生素和酵母粉，并需加入抑制正常菌群生长的杆菌肽和其他抗生素,来提高分离率。这样不仅加大工作量,而且提高了试验成本,故我国许多实验室尚未很好地解决分离嗜血杆菌的问题。现介绍一种纸片分离嗜血杆菌的方法,它只在血平板上贴一种特制的纸片,就可选择出嗜血杆菌。报告如下。

材料和方法

一、材料

1.菌株:流感嗜血杆菌标准菌株ATCC49766、ATCC49247，由卫生部生物制品检定所提供；临床分离2株流感嗜血杆菌，由卫生部临床检验中心和北京儿科研究所提供；临床流感嗜血杆菌19株和其他嗜血杆菌51株,均由本院临床分离。

2.分离培养基：5%羊血肉浸液血琼脂平板(牛肉汤,1%蛋白胨,0.5%NaCl,1.5%琼脂和5%羊血,pH 7.2),VBC巧克力平板(制作方法见参考文献［2］),普通肉汤巧克力平板(牛肉汤,1%蛋白胨，0.5%NaCl，1.5%琼脂消毒后，80℃时加5%羊血制成巧克力平板,pH7.2)。

二、方法

1.细菌鉴定:可疑菌落同时接种于血平板和M-H平板上进行卫星试验,初步鉴定流感嗜血杆菌和其他嗜血杆菌，用APINH嗜血杆菌鉴定板(法国生物梅里埃公司产品)进行最终鉴定。

2.分离嗜血杆菌纸片的研制：通过观察比较各成分不同浓度对嗜血杆菌的影响,确定纸片含各种成分的最终浓度(含万古霉素45 μg,杆菌肽300 μg,辅酶Ⅰ700 μg和酵母粉150 μg)。干燥后,-30℃保存备用。对不同纸片的形状进行观察比较后,发现长条状纸片优于圆形纸片。它可同时贴于划线平板的不同区域,即从原始划线处到分出单个菌落处,这样有利于提高嗜血杆菌的分离，其最终大小为25 mm×4 mm。

3.纸片法分离各种嗜血杆菌的操作方法：将各种欲分离嗜血杆菌的标本,如痰、生殖系统拭子和脑脊液等标本用常规方法接种于营养丰富的血平板上,将分离嗜血杆菌纸条一端贴于原始划线处,另一端贴向低浓度划线区域(采用三区划线法时,纸条从一区向二、三区方向贴),放入CO₂培养箱中过夜培养,第二天观察结果,选择纸片周围生长而远离纸片不能生长的菌落,嗜血杆菌菌落多细小、透明、光滑，一些菌株较湿润,同时注意细菌的溶血情况。然后用血平板和M-H平板卫星试验进行初步鉴定,最终用API NH微量鉴定条进行鉴定。如果24小时观察困难或细菌生长不良,需48小时后继续观察。

4.模拟阳性标本的配制：将上述流感嗜血杆菌标准菌株 ATCC49766、ATCC49247，临床分离的2株流感嗜血杆菌,分别制成0.5个麦氏管浓度的菌悬液,定量加入嗜血杆菌阴性痰标本中(痰标本经VBC巧克力平板培养鉴定为阴性),制成流感嗜血杆菌不同浓度的模拟阳性痰标本。

结果

1.纸条不同成分对嗜血杆菌生长的影响：制备3种纸条，纸条Ⅰ含万古霉素45 μg,杆菌肽300 μg,辅酶I 700 μg,酵母粉150 μg；纸条Ⅱ含辅酶Ⅰ700 μg；纸条Ⅲ含万古霉素45 μg,杆菌肽300 μg,酵母粉150 μg。将流感嗜血杆菌同时接种血平板和M-H平板上,3种纸条分别贴于表面,37℃,5%CO₂环境培养24小时,观察3种纸条周围流感嗜血杆菌生长情况,在血平板上,纸条Ⅰ周围有一非常小的抑菌环,在抑菌环外有大量流感嗜血杆菌生长环；纸条Ⅱ周围有流感嗜血杆菌生长环；纸条Ⅲ周围无流感嗜血杆菌生长。M-H平板上,3种纸条均无流感嗜血杆菌生长。

2.流感嗜血杆菌在3种培养方法上的生长情况比较：对传统巧克力平板法、VBC巧克力平板法和自建的血平板纸片法流感嗜血杆菌生长情况进行观察。以其在传统的巧克力平板上每平方厘米形成的菌落数为100%进行比较,观察单位内菌落数和菌落大小。其中传统的巧克力平板上单位菌落数为100%,菌落较大,约为1.5 mm；VBC巧克力平板上单位菌落数为92.4%,菌落较传统巧克力平板的菌落略小,约1.2 mm；在血平板纸片法上,其菌落的多少和大小均与纸片间的不同距离而变化,就菌落生长较好的区域,其单位菌落数为其95.6%,菌落大小约为1.2 mm。

3.比较不同培养方法对模拟流感嗜血杆菌阳性痰标本的分离情况：用传统的巧克力平板法、VBC巧克力平板法、自建的血平板纸片法和血平板上金葡菌划线法对100株不同浓度的模拟流感嗜血杆菌阳性痰标本和50株嗜血杆菌阴性痰标本进行分离比较。结果100株模拟阳性痰标本，4种方法的分离率分别为64%、76%、84%和28%。巧克力平板法与VBC巧克力平板法进行配对卡方检验,结果χ²=7.56,P＜0.01,其结果差异有显著性。巧克力平板法与血平板纸片法进行配对卡方检验,结果χ²=16.3,P＜0.01,其结果差异也有显著性。

4.临床痰标本分离嗜血杆菌比较:用VBC巧克力平板法和自建的血平板纸片法对我院呼吸内科患者162份痰标本同时配对进行分离培养,后对79份痰标本用自建的血平板纸片法进行分离培养,其中VBC巧克力平板法分离痰标本162份,分离流感嗜血杆菌7株(分离率为4.3%),其他嗜血杆菌18株。血平板纸片法分离痰标本241份,分离流感嗜血杆菌12株(分离率为4.98%),其他嗜血杆菌33株。进行卡方检验后,其结果χ²=0.09,P＞0.05,结果无差异。

讨论

提高嗜血杆菌分离率是目前急需解决的问题。由于各种原因，实验室往往忽略嗜血杆菌的培养，近年来，国内许多同仁在嗜血杆菌培养方法学方面进行了探索。

从流感嗜血杆菌标准菌株的菌液在各培养基上生长状况看，传统的巧克力平板上生长情况更佳，而VBC巧克力平板和纸片法血平板上生长相似，后者可能与抗生素的加入有关。但在有正常菌群影响的情况下，传统巧克力平板就不能很好地分离嗜血杆菌，通过对150份的模拟痰标本和临床标本的检测说明，在有正常菌群的情况下，采用加入抗生素的方法，如VBC法和纸片法较不加抗生素的方法效果好,这同国内外的报道相似。在血平板上用纸片法分离嗜血杆菌属是一种较适合我国现状的方法，它操作简便，不需要增加更多的培养基，减轻了接种的工作量，但阳性菌落尚需用卫星试验或X、V因子试验鉴别到种，即区别流感嗜血杆菌和其他嗜血杆菌各种。

参考文献

1Campos JM. Haemophilus. In: Murray PR,Baron EJ,P faller MA, et al. Manual of clinical microbiology, 6th ed. Washington D C: ASM Press, 1995. 556-566.

2Chapin KC,Doern GV. Selective media for recovery of Haemophilus influenzae from specimens contaminated