关键词： 胞外糖；细菌染色；阿利新蓝；刚果红

【摘要】目的建立细菌胞外糖显微镜常规检测方法，确定胞外糖作为细菌定植和致病因素的实验依据。方法采用pH2.5的阿利新蓝水溶液与刚果红水溶液联合对细菌胞外糖染色，以不产生胞外糖的枯草芽胞杆菌作为阴性对照，及以Costerton的细菌胞外糖透射电镜观察法作为阳性对照。结果细菌细胞呈淡红色，胞外糖为深红色，背景呈蓝色。结论该方法简便易行，结果可靠，重复性好。比Costerton的方法经济，更易推广。

Bacterial glycocalyx stain analyzed by light microscopical techniqueWang Yuan, Cong Yanguang, Liu Junkang, et al. Department of laboratory Medicine, Third Military Medical University, Chongqing 630038

【Abstract】ObjectiveTo set up a routine light microscopically technique and define basis of glycocalyx as colonizing-virulence factor of bacteria or bacterial cryptic growth cells.MethodsUsing Alcian blue (pH 2.5) combined with Congo red the staining is satisfactory.ResultsWe got the stained colour as light red cells, dark red glycocalyx and blue background.ConclusionThe newly developed method has certain advantages. It is simpler and easier than Costerton′s procedures. This technique revealed economy for use, and it has wide range of applications.

【Key words】GlycocalyxBacterial stainAlcian blueCongo red

微生物学试验中常用菌落拉丝现象作为鉴定细菌的特征之一。实际上几乎所有的菌落均有一定粘性，这种粘性表明菌落的组成除了细菌细胞以外，细胞之间还存在着称为胞外糖的粘性物质。细菌胞外糖也称glycocalyx，是Costerton等^［1］70年代研究细菌群体结构时用电镜确定下来的。研究人员^［2］明确提出细菌胞外糖与细菌致病性有关。Costerton等人^［3］主要研究细菌的biofilm，认为胞外糖产生及作用是biofilm形成的机制之一。我们早期工作也观察到了细菌胞外糖使细菌群集形成砖墙样有序结构^［4］。关于胞外糖在医学微生物学中的作用较多：胞外糖使细菌群集抵抗吞噬；能够保护细菌不与抗体结合；形成群集内细菌交替性生长，Cheng等^［5］称之为隐性生长；胞外糖还可以帮助细菌群体向周围获得足够营养。这方面的基础工作已较多，但是对胞外糖的研究成果一直未在临床广泛应用，主要因为Costerton等^［1］是采用钌红染色后做透射电镜观察，需抗体包被，试验方法复杂，周期较长，不易推广。近年来，临床微生物学研究工作开始探索用染料对细菌胞外多糖进行染色，以简便的观察方式判定胞外糖的多少，用于鉴定细菌。Freeman等^［6］用刚果红对菌落中的多糖进行染色，直接向培养基中加入刚果红染料，在菌落形成过程中即可显色，这种鉴定方法在实际中有一定作用。更有实际意义的是对单个或部分细菌细胞的观察，我们在生物波的试验研究中，需要观察单个细菌或潜生体(cryptic growth cells,&127;CGC)的胞外糖，以确定胞外糖在CGC定植过程中的作用。为此我们进行了一些相关的染色试验，获得了较满意的效果，报道如下。

材料和方法

一、材料

1.菌株来源：绿脓假单胞菌菌种、绿脓假单胞菌分型抗血清、枯草芽胞杆菌，均购自卫生部成都生物制品研究所；绿脓假单胞菌潜生体,由本研究中心从烧伤病人伤口脓液标本中分离、培养鉴定；大肠埃希菌，由西南医院烧伤研究所分离、鉴定。

二、方法

1.染液配制：(1)阿利新蓝(AB)染液：阿利新蓝2 g，冰醋酸3 ml，蒸馏水97 ml；(2)刚果红染液：刚果红2 g，蒸馏水100 ml。

2．刚果红-阿利新蓝染色方法：滴生理盐水少许于洁净载玻片上，用接种针挑取细菌与之混匀后,再滴加与生理盐水等量的AB染液,混匀,静置3～5分钟，火焰加热固定,直到染液挥发完全,然后滴加少许刚果红染液,均匀涂布,火焰加热干燥后,用蒸馏水冲洗至没有染料流下为止,水吸干后用油镜观察。

3.采用Costerton^［1］的方法,用透射电镜观察血清8型绿脓假单胞菌的胞外糖与该方法相比较。

结果

刚果红－阿利新蓝染色法结果对以上几种试验菌株取得基本一致结果:&127;细菌为淡红色、边缘清晰，围绕菌体一圈颜色为深红色的胞外糖，背景为淡蓝色。见图1～3。

讨论

本试验采用无胞外糖的枯草芽胞菌作为阴性对照(图4)，并结合钌红抗体包被电镜观察结果相比较，证明该染色方法特异性强；绿脓假单胞菌(pseudomona aeruginosa,PA)在培养过程中胞外糖呈不断增加的趋势，从生长对数期开始到衰退期连续动态观察，共进行10次，PA胞外糖从对数期开始为阳性，培养24～48小时，胞外糖逐步增加。10次试验的结果大致相同，表明该染色法的重复性好，可以观察到细菌早期形成的胞外糖，表明该方法敏感性高；从所用时间及结果比较，该方法较钌红染色透射电镜观察法快速、简便、易于推广。

刚果红曾被报道^［6］用于加入培养基中，检测抗凝固酶葡萄球菌产生的粘液，而阿利新蓝在组织化学中常规应用于机体组织粘蛋白染色，两者配合起来应用于细菌胞外糖染色较好，其染色机理还不清楚，有待进一步研究。

在最初的研究中我们曾单独用刚果红 、AB染液 、钌红染液对胞外糖染色，结果都不理想。在染色完毕用水冲掉多余染液时，胞外多糖也随之被冲掉，光镜下只见菌体周围有一圈较模糊的空圈或完全不着色;如果染后不冲洗,刚果红、AB染色后的玻片则无法用显微镜观察。在最初考虑用刚果红染色与AB混合染色是想让菌体染成蓝色，多糖染成红色，但多次结果均不理想；又不能在染色完毕后用水冲洗，而无法观察。最后考虑到改变染液的pH使胞外糖中的蛋白成分变性，以增强胞外糖固定效果。经多次试验，最终取得满意效果：菌体为淡红色，胞外糖为深红色，边界清晰，背景为淡蓝色。在试验过程中观察到阿利新蓝染液的pH十分重要，需在酸性(pH 2.5) 环境染色较好,而刚果红在酸性环境中会变成棕黑色，并产生沉淀，因此AB染液在固定细菌时必须烤干，让其中醋酸挥发完全，使后来加上的刚果红不会变性。经过这样处理后，多糖不易被水冲掉。我们推测胞外糖、阿利新蓝、刚果红三者之间存在某种化学反应。

采用几种染料，对细菌胞外糖染色。比较结果以AB－刚果红结合染色法最好。优点是方法可靠，连续染色50份标本，结果均为阳性，表明方法重复性好；用电镜观察胞外糖作对照发现结果一致；用芽胞杆菌作胞外糖阴性对照，多次重复均为阴性，表明染色方法特异性强。这种染色方法操作简便易行，用途广泛，可用于细菌胞外糖观察，也将在临床微生物原位标本检验中有较广的应用价值。

图1绿脓假单胞菌外糖染色显微镜观察×100图2绿脓假单胞菌潜生体胞外糖染色显微镜观察×1000图3大肠埃希菌胞外糖染色显微镜观察×1000图4枯草杆菌（阴性对照）与绿脓假单胞菌混合用刚果红-阿利蓝染色×1000

本研究课题为国家自然科学基金资助项目(基金编号 39370008)

参考文献

1Costerton J W, Ingam J M，Cheng K J. Structure and function of the cell envelope of gram negative bacteria. Bacteriol Rev, 1974,38:87-89.

2Costerton J W, Geesey G G, Cheng K J. How bacteria stick. Sci Am 1978,238:86-90.

3Costerton J W, Irvin R T, Cheng K J. The bacterial glycocalyx in nature and disease. Annu Rev Microbiol， 1981, 35:299-305.

4徐启旺．烫伤创面绿脓杆菌定植动态的实验研究.中国微生态杂志，1989，1：34-39.

5Cheng K J, Irvin R T. Autochthonous and pathogenic colonization of animal tissues by bacteria. Can J Microbiol, 1981,27:461-464.

6Freeman D J. New method for detecting slime production by coagulase negative staphy lococci. J Clin Pathol, 1989,42:872-876.

(收稿：1998-03-10修回：1998-05-25)