裂解酶片段长度多态性(CFLP)技术具有快速、灵敏、准确、操作简便等优点^［1］，我们根据现有的条件将方法略加修改，初步对沙眼衣原体(Ct)基因做了分型。

一、材料与方法

(一)材料

1.标本：婴儿鼻咽部刮取标本用McCoy细胞培养分离Ct，随机取阳性培养标本5份。

2.试剂：Taq DNA聚合酶、缓冲系统及透析袋为Sigma公司产品；T7DNA聚合酶测序试剂盒为Promegar公司生产，CFLPScan Kit为宝灵曼公司产品；［α-³⁵S］dATP(10 μCi/μl，Amersham公司产品)。

3.仪器：RNA/DNA计算机为Biotech公司产品；1169基因扩增仪为北京新技术应用研究所产品；测序电泳仪为BIO-RAD Model 3000Xi。

(二)方法

1.聚合酶链反应(PCR)：Ct主要外膜蛋白基因第四可变区(omp1 VS4)两端稳定区分别作为上下游引物，上游引物为：5′-GGCAAGCAAATTTAGCTCTCTCT-3′(815-837)；下游引物为5′-GTTCCTACTGCAATACCGCAAGA-3′(1068-1091)。目的片段277 bp。

2.特异性DNA标记及单链的形成：将纯化浓缩的277bp片段DNA作为模板，利用T7DNA聚合酶测序试剂盒标记部分，用2 mol/L氢氧化钠使模板DNA裂解为单链，加入上游引物12.5 pmol与之退火，然后加入1.3 μl［α-³⁵S］dATP及稀释的标记混合物及7UT7DNA聚合酶，置室温延伸5分钟，使［α-³⁵S］dATP标记在5′次末端(即引物之后)加入dNTPs(各100 μmol/L)，继续延伸以形成特异的有标记的DNA单链。

3.裂解反应：按CFLPScan Kit操作说明，用DNA稀释缓冲液15 μl溶解DNA，加石蜡油1滴，经水浴锅95℃变性20秒，立即换入55℃经15秒，加5 μl酶/缓冲液，混匀后继续保温2分钟，再加16 μl停止液。

4.电泳与显影：8%变性聚丙烯酰胺灌于自制的8×13×0.04 cm的两块玻璃板之间，置40℃聚合1小时，然后用0.5×TBE缓冲液垂直电泳(600 V，10 mA)，预热电泳40分钟，待凝胶温度升到55℃时点样8 μl，继续电泳至溴酚蓝达底部，在80℃中干燥，用Kodak XK-1X光片曝光5天，显影、定影。

二、结果

PCR产物经纯化与浓缩后电泳比较：点样孔及泳道上非特异性显影消失，特异性277 bp条带更清晰明亮，测得其DNA浓度0.05～0.28 μg/μl。CFLP图谱显示：1、2、5号标本为相同的10个条带，3、4号标本为另一相同的13个条带，经DNA测序结果分别属于E和F型。

三、讨论

CFLP基本原理是：先将DNA加热变性，然后冷却到一定温度，被分开的单链DNA会按碱基配对规律自身形成特定的发夹圈。经裂解酶Ⅰ切断其底部5′端核苷酸链，电泳后，有标记的一段显影，即为CFLP图谱。研究证明omp1 VS4的序列能敏锐地测出Ct型别和核苷酸置换引起的抗原变异^［2］，Poole等^［3］选用该段DNA为测序对象，对125个泌尿道Ct分离株测序，不但能分型，并新发现3个亚型，还区分出混合感染和再感染。所以，我们亦选用该片段行CFLP分析，对Ct基因分型进行初步尝试，将为建立一种崭新的Ct基因分型系统打下一定的基础。

本课题为国家自然科学基金资助项目(基金编号39670766)

参考文献

1Brow MA，Oldenburg MC, Lyamichev V, et al. Differentiation of bacterial 16S rRNA genes and intergenic regions and Mycobacterium tuberculosis katG gens by structare-specific endonuclease cleavage. J Clin Microbiol,1996,34：3129-3137.

2沈犁,吴仕孝,苏国富,等.沙眼衣原体主要外膜蛋白第四可变区DNA的克隆.序列分析及初步应用.中华微生物和免疫学杂志,1995,15：14-17.

3 Poole E, Lamont I. Chlamydia&127;trachomatis serovar differentiation by direct sequence analysis of the variable segment 4 region of the major outer membrane protein gene. Infect Immun, 1992,60：1089-1094.

(收稿：1997-11-05修回：1998-03-24)