在DNA突变检测方法中，DNA测序能精确判断突变部位和性质，是最具决定性的一步。聚合酶链反应(PCR)产物经直接测序分析而不预先克隆到测序载体上，使序列分析的效率极大提高。我们从遗传性高铁血红蛋白血症患者外周血白细胞提取总RNA，经逆转录(RT)合成cDNA，用半巢式PCR方法扩增其NADH-细胞色素b5还原酶编码基因，并进行了PCR产物直接序列分析，取得满意的结果。证明逆转录PCR产物直接测序法是检测基因错义突变的迅速有效的方法。

一、试剂和方法

1.试剂：RNA提取及逆转录试剂盒、测序试剂盒为Promega公司产品。γ-³²P-ATP购自亚辉生物工程公司。Taq酶购自Sangon公司。PCR扩增仪为PE2400。手工测序装置为Bio-Rad产品。自行设计并由Sangon公司合成的用于半巢式PCR扩增b5还原酶cDNA的一对外引物是：

上游引物P₁：5′GGGAATTCATGGGG-GCCCAGCTCAGCACG 3′；下游引物P₂：5′GGGGATCCCCTCAGAAGACGAAGCACGGC3′；一条内引物P3：5′ GATGACCAGGTCCACGAACC 3′。

2.RT-PCR方法：正常人和遗传性高铁血红蛋白患者的外周血白细胞总RNA的提取和cDNA第一链的合成按说明书进行。取1.0 μlcDNA(约200 ng)、引物P1和P2各15 pmol/L、10×PCR缓冲液2.5 μl、dNTP 5.0 mmol，补水至25 μl。经94℃45秒-60℃45秒-72℃1分钟，共30个循环。取1.0 μl产物作模板，引物P1、P3各15 pmol，补加其他试剂及反应循环条件同上，作半巢式PCR扩增。最后产物经1.2%普通琼脂糖电泳，用新刀片切取目的条带，加5倍体积TE缓冲液冻融，高速离心；取上清，用酚、酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤；溶于去离子水作测序模板。

序列分析：测序引物(P1、P3)标记γ-³²P-ATP(37℃1小时)。取标记引物3.0 μl(含1.5 pmol/L)、5×Taq测序缓冲液5.0 μl、测序级Taq酶1.0 μl(5U)、模板1.0 μl(约30～50 ng)，补水6 μl，混匀后各分装4.0 μl于分别加有4种dNTP和1种ddNTP的4个反应管。测序循环反应条件：经94℃30秒-60℃30秒～72℃45秒，共35个循环。反应结束后加4.0 μl终止液，85℃变性3分钟，上样于6%聚丙烯酰胺凝胶(含8 mol/L尿素)电泳分离(120 W、50 mA、50℃)。湿胶压片，置于-20℃放射自显影35小时。

二、结果和讨论

半巢式PCR扩增出长338 bp的DNA片断。同位素标记两条测序引物(P1、P2)分别做测序反应，并各经两次上样电泳，通读了这一序列。与正常对照结果比较，发现两个家系的患者b5R基因第57密码子存在错义突变(CGG→CAG)；另一个家系患者b5R基因的突变位点出现在第72密码子(CTC→CCC)，为国内外首次发现。

PCR产物直接测序法对模板的纯度要求高。模板的制备是关键步骤。现有市售许多PCR产物回收纯化的试剂盒，简捷、效果好。我们采用普通琼脂糖凝胶冻融回收法纯化PCR产物制备测序模板，也得到满意的效果。另外，实验中发现适当延长测序引物的标记时间可增强条带信号，而背景不受影响。

由于外显子仅占基因组DNA的一小部分，从细胞总RNA反转录成cDNA(免去提取mRNA的繁杂的步骤)，再用PCR方法扩增其编码序列进行分析，能快速检测出存在于外显子的错义突变。证明RT-PCR产物直接测序法是检测基因错义突变的非常有效的方法。(收稿：1997-08-15)