关键词： 聚合酶链反应；疟原虫恶性

【摘要】目的应用一种简易、快速的复合PCR扩增系统检测恶性疟原虫及混合感染。方法以间日疟原虫(P.v)和恶性疟原虫(P.f)小亚单位核糖体核糖核酸基因(SSUrDNA)特定片段为靶基因，设计并合成引物，建立复合PCR扩增系统。采用煮沸法快速制备DNA模板研究本系统的敏感性和特异性，并用于临床血样的检测。结果从P.v和P.f感染血样中分别扩增出分子量大小为705 bp和575 bp的特定扩增带。而食蟹猴疟原虫、诺氏疟原虫及正常人血样均无扩增带出现。单独检测P.f敏感度达到0.47×10^-6(约2虫/μl全血)，在P.v存在的情况下，检测P.f敏感度为0.47×10^-5。检测104例疟区门诊患者冻存血标本，84例与镜检法结果相同，并发现24例混合感染和2例为镜检虫种鉴别失误。结论本系统敏感性高，特异性强，操作简单，并可在一次扩增中同时检出P.v和P.f，具有一定的推广应用价值。

Detection of plasmodium falciparum with a multiplex PCR system from patientsSun Minglin, Xue Caifang, Fan Rong, Liu Zhongxiang Department of Parasitology, Fourth Military Medical University, Xi′an 710032

【Abstract】ObjectiveTo detect plasmodium falciparum (P.f) and mixed infections with a simple, rapid and practical multiplex PCR system from patients of Yunnan.MethodsAccording to the sequences of the small subunit ribosomal DNA (SSUrDNA) fragments of P.v and P.f, primers were designed and synthetized to establish the multiplex PCR system. Templates were prepared by a rapid boiling method to test the sensitivity and specificity of the system, then 104 conserved blood samples of clinical patients were detected.ResultsDNA fragments about 705 and 575 base pairs were successfully amplified by multiplex PCR from the genomic DNA of P.v and P.f, but no fragments were obtained from those of P.kochi, P.cynmolgi and humans. It was confirmed that the amplified fragments was indeed expected SSUrDNA fragments of P.v and P.f by means of restriction endonuclease digestion. This method was successful in detecting P.v about 2 parasite/μl whole blood. While amplifing P.f with P.v in the same time, the sensitivity was about 20 parasite/μl whole blood. 104 samples were detected by this system. Of these, 84 showed same results detected by microscopy. By the multiplex PCR system 24 samples were also shown mixed infections, whereas by microscopy P.f only. Another 2 samples were shown P.f positive by microscopy, and verified to be P.v by the multiplex PCR.ConclusionThe ease of operation combined with the sensitivity and specificity, especially for the detection of mixed infection in one reaction suggest that this multiplex PCR system might be a valuable tool for malaria diagnosis.

【Key words】Polymerase chain reactionPlasmodium falciparum

长期以来，疟疾诊断一直采用镜检患者血涂片的方法。由于此方法费时费力，敏感性和准确性受多种客观因素影响，已难以适应目前疟疾防治工作的要求。尤其是对混合感染的漏检和虫种鉴别的失误，严重影响了临床的治疗和预防工作。因此，国内外众多学者都在寻找一种更加灵敏、高效、特异的疟疾诊断新方法。我们以疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸基因(SSUrDNA)特定片段为目的基因建立了一种疟疾复合PCR检测系统，可在一次扩增中灵敏、准确地同时检出间日疟原虫和恶性疟原虫，并用于门诊患者的检测，现报告如下。

材料和方法

1.标本：恶性疟原虫(P.f)和间日疟原虫(P.v)阳性标本采自云南及海南省疟区，实验室镜检血涂片，计数并推算原虫率；门诊患者血样于1987～1997年采自云南省西双版纳州疟疾高发区，由当地防疫部门镜检技术人员现场以厚血膜法检测；食蟹猴疟原虫(P.c)、诺氏疟原虫(P.k)由本教研室提供；正常人血样采自本校附属西京医院血库。

2.模板DNA的制备：经实验室镜检确认为P.f和P.v感染者冻存血样、P.c、P.k及正常人血标本参照Sambrook等^［1］方法以酚/氯仿抽提DNA模板。门诊患者待检血样采用作者建立并改进的煮沸法快速制备DNA模板。

3.PCR引物设计：在序列测定和分析的基础上，以疟原虫SSUrDNA特定片段为靶基因，设计出复合PCR系统所用引物S₁～S₃。S₁为疟原虫属特异性上游引物：5′-GGATAACTAC GGAAA AGCTG-3′；S₂和S₃分别为P.v 和P.f种特异性下游引物，S₂：5′-AAACG GCGCA ATGCT ATATC-3′，S₃：5′-GGAAG CGTAT TAAAG CGAA-3′。以上引物经相关计算机软件分析后合成，PAGE法纯化。双蒸水稀释备用。

4.PCR扩增及产物鉴定：引物S₁工作浓度为60 pmol/L，S₂和S₃均为50 pmol/L，DNA模板5 μl，Taq酶0.5 U，其余试剂参照有关使用说明书(4×dNTP各200 μmol/L，10×Buffer 2.5 μl，25 mmol/L KCl 2.5 μl)，双蒸水补足总体积至25 μl，液体石蜡油25 μl封闭。94℃变性3分钟后进入PCR循环，采用双温度点扩增法：91℃变性30秒，65℃退火并延伸90秒；30个循环后电泳观察结果。如进一步鉴定，可用低熔点琼脂糖凝胶法回收阳性产物，以限制性内切酶进行酶切分析。

结果

1.特异性：在相同条件下提取P.v、P.f、P.c、P.k阳性血样和40份厚血膜法检测均为阴性的正常人血样基因组DNA为模板，用本系统进行PCR扩增，仅P.v和P.f感染血样分别出现一条分子量为705 bp和575 bp的特定扩增带，其余均无产物出现(图1)。分别将P.v和P.f阳性产物用低熔点琼脂糖凝胶法回收，以单一酶切位点的限制性内切酶DraⅠ进行消化，P.v产物被酶切为388 bp和317 bp的两条片段，而P.f产物则被酶切为391 bp 184 bp的两条片段，与预期结果完全相符，证实扩增产物为目的片段。说明本系统特异性强，在相近原虫及人DNA中不产生非特异性扩增。

2.敏感度：取原虫率为0.47%的P.f感染血样，用正常人血样进行10倍梯度稀释，煮沸法快速制备DNA模板，PCR平行扩增并重复实验，当原虫率为0.47×10^-6(约2虫/μl全血)时，仍可出现阳性产物(图2)，敏感度较厚血膜镜检法高100倍以上。在上述血样中加入P.v感染血样，用同样方法稀释并使P.v原虫率均为0.08%，制备DNA模板进行PCR平行扩增，结果显示在P.v存在的情况下，本系统可检出P.f的原虫率约为0.47×10^-5(约20虫/μl全血)(图3)，说明有P.v存在时，对P.f的扩增有微弱影响，但敏感度仍远远高于厚血膜镜检法。

1：DNA分子量标准参照物 2：YNP.v/9701 3：HNP.v/9715 4：HNP.f/FCC 5：YNP.f/9705 6：P.c 7：P.k 8：健康对照

图1复合PCR检测间日疟原虫、恶性疟原虫的特异性

1：DNA分子量标准参照物 2～7：P.f 原虫率0.43×10^-2～0.43×10^-7

图2复合PCR检测恶性疟原虫的敏感性

1～5：均为混合血样(P.f原虫率0.43×10^-2～0.43×10^-6P.v原虫率均为0.08%)

图3间日疟原虫存在时，检测恶性疟原虫的敏感性

3.门诊病人血样的检测：1987～1997年采自云南省疟区门诊患者冻存血标本104例，由当地防疫部门镜检技术人员在现场以厚血膜法检测为，P.f感染者79例；P.v和P.f混合感染25例。用本系统检测，79例镜检为P.f感染者中，51例出现P.f阳性扩增产物；2例为P.v阳性；24例扩增出P.v和P.f两条目的片段，提示为混合感染；另外2例无阳性扩增带出现。25例镜检为P.v和P.f混合感染的血样，用本系统检测，2例仅出现一条P.v阳性扩增带，其余23例与镜检结果相符。将30例扩增结果与镜检不相符的标本重复实验，结果无变化。将其中P.v和P.f阳性产物分别回收后酶切鉴定，证实扩增产物为P.v和P.f目的片段。说明本系统具有纠正厚血膜镜检法虫种鉴定失误、减少或避免混合感染中某种原虫漏检的潜力。2份假阳性标本可能与原虫基因水平的变异或血样采集、转运等方面的误差有关，具体原因有待进一步研究。

讨论

疟疾是传播广泛危害严重的重要寄生虫病之一，高效、准确的诊断是及时治疗、减少传播的前提，也是目前疟疾防治工作亟待解决的问题。虽然显微镜镜检染色血涂片的方法简单易行，但存在诊断准确率有限，检测效率<