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【摘要】目的建立灵敏度高、选择性好的2-(8′-羟基喹啉-5′-磺酸-7′-偶氮)-变色酸(简称8Q5SAC)血清钙络合解离测定法。方法在甘氨酸-NaOH缓冲介质中，8Q5SAC与钙、镁等金属离子络合显色，加入EGTA使8Q5SAC与钙解离，以测定吸光度的下降值分析血清钙。对反应条件、方法性能进行系统研究。结果该法线性0～5 mmol/L，平均回收率99.3%，变异系数0.56%～1.81%。与邻甲酚酞络合酮法对照，r=0.998，P＞0.5；与甲基百里酚蓝法对照，r=0.993，P＞0.05。结论该法试剂稳定，灵敏度、选择性及测试线性均优于或相当于邻甲酚酞络合酮法和MTB法，可用于血清钙的常规分析，尤其适合于自动分析。
UV-spectrophotometric determination of calcium in serum by complexing with 2-(8′-quinolinol-5′-sulfo-7′-azo)-chromotropic acid and dissociated by EGTAChen Liping, Huang Yajuan, Hu Kanglin, et al. 101 st Hospital of PLA, Wuxi 214044
【Abstract】ObjectiveTo create a high-sensitivity and good-selectivity method for the determination of calcium in serum by UV-spectrophotometry with 2-(8′-Quinolinol-5′-sulfo-7′-azo)-chromotropic acid (8Q5SAC).Methods8Q5SAC was used as a coloring reagent to react on such metalions as calcium and magnesium and to develop color in the glycine-NaOH buffer system. EGTA was added for dissociating calcium from 8Q5SAC. Calcium was analyzed by the determination of the absorbent declining volume. The systematic studies of reaction conditions and properties of the method were made.ResultsThe linearity was 0～5(mmol/L), the average rate of recovery was 99.3%, and CV 0.56%～1.81%. Comparison with OCPC, showed that r=0.998, P＞0.5 and with MTB, r=0.993, P＞0.05.ConclusionsThe reagent is stable. Its sensitivity, selectivity and linearity are better than or the same as those of OCPC′s and MTB′s. The method is suitable for the routine analysis of calcium in serum, especially for automatic analysis.
【Key words】CalciumChelating agents
血清钙测定的参考方法是原子吸收分光光度法，不适于常规分析。使用络合剂显色的比色法操作简便，反应速度快，其中的甲基百里酚蓝(MTB)法和邻甲酚酞络合酮(OCPC)法［1］正被临床实验室广泛采用。但两法的灵敏度、试剂和显色的稳定性及MTB法的测试线性均不甚理想。我们使用国内合成的金属离子络合剂2-(8′-羟基喹啉-5′-磺酸-7′-偶氮)-变色酸［2-(8′-quinolinol-5′-sulfo-7′-azo)-chromotropic acid，简称8Q5SAC］进行了血清钙测定的方法学研究，现予以报道。
原理
8Q5SAC在碱性缓冲介质中与血清中的钙、镁等金属离子络合显色。8Q5SAC-钙在波长518 nm处有一吸收峰。加入乙二醇双(α-氨基乙基)醚四乙酸(简称EGTA)，8Q5SAC-钙被解离，反应液吸光度下降。反应液518 nm处的吸光度下降值与钙离子浓度在一定范围内成正比。
材料与方法
一、试剂
1.试剂1(显色液)：0.35 mmol/L 8Q5SAC(南昌大学应用化学所合成)。
2.试剂2(基础液)：甘氨酸7.507 g，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)5 g，叠氮钠1 g，以水分别溶解后混合，加聚乙烯辛基苯基醚(乳化剂OP)6 ml，1 mol/L NaOH 112 ml。混匀后加水至1 L。
3.试剂3：0.8 mmol/L EGTA，以75 mmol/L NaOH配制。
4.应用试剂：试剂1、2等量混合。应用试剂pH11，每升含8Q5SAC 0.175 mmol，甘氨酸50 mmol，NaOH 56 mmol，PVP 2.5 g，乳化剂OP 3 ml，叠氮钠7.6 mmol。4℃遮光密闭，试剂1、2、3均可长期贮存，应用试剂有效期为两周。
5. 2.50 mmol/L钙标准液。
二、仪器
岛津UV-2401紫外可见分光光度计；722型分光光度；日立7060自动生化分析仪；pH计。
三、方法
1.手工测试：测定管、标准管、空白管分别加入血清、钙标准液、水各20 μl，每管加应用试剂3 ml，混匀后以520 nm波长，空白管调零，读取各管吸光度为A1。每管加EGTA试剂0.3 ml，混匀后再以空白管调零读取各管吸光度为A2。
钙(mmol/L)=［测定(A2-A1)/标准(A2-A1)］×2.50
2.自动分析：7060分析仪。主要参数：标准液浓度S1，0，S2，2.5，样品量3 μl，测试方法两点法，副/主波长800 nm/505 nm，测定点(15)(30)，试剂T1(显色液)250 μl，T2(基础液)250 μl，T3(EGTA试剂)50 μl。
结果
1.吸收光谱：以水为参照，应用试剂的吸收光谱见图1。以应用试剂为参照，8Q5SAC-钙的吸收光谱在518 mn处有一吸收峰(图2)。以水为参照，在波长770～800 nm段应用试剂、钙反应液以及镁、锌、铜、铁等非钙金属离子反应液的吸光度值基本一致。选择手工测试波长为520 nm。根据7060分析仪的波长设置，选择自动分析的(副/主)测试波长为800 nm/505 nm。505 nm处的显色灵敏度略低于518 nm。
2.缓冲体系及pH选择：选择甘氨酸-NaOH缓冲体系。配制不同pH的应用试剂与钙标准液反应，钙显色的最适pH范围在10.5～11.2。以pH11、甘氨酸浓度25～100 mmol/L的应用试剂观察钙测试灵敏度，甘氨酸浓度50 mmol/L时较为适宜。
3.8Q5SAC浓度选择：8Q5SAC浓度与应用试剂的吸光度成正比，显色灵敏度随8Q5SAC浓度的增高而上升；浓度增至0.125 mmol/L，灵敏度不再增加(图3)；8Q5SAC浓度为0.175 mmol/L时，钙显色的线性范围可达6 mmol/L。选择应用试剂的8Q5SAC浓度为0.175 mmol/L。
图1应用试剂的吸收曲线
图28Q5SAC-钙的光吸收曲线
图38Q5SAC浓度与吸光度变化
4.PVP和乳化剂OP浓度选择：PVP和乳化剂OP在反应体系中可防止蛋白质干扰，降低空白吸光度，增加反应灵敏度。两者在应用试剂中的浓度分别为2.5 g/L和3 ml/L时较为适宜。
5.EGTA浓度及用量的选择：在pH11的反应介质中，8Q5SAC对钙和镁的选择性相似，与锌、铜、铁等离子也能显色，EGTA对钙的选择性明显高于8Q5SAC，对镁、锌、铜、铁的选择性明显低于8Q5SAC。考虑减小EGTA试剂对反应液的稀释作用，确定其用量为应用试剂量的1/10。观察EGTA试剂浓度对钙及非钙金属离子反应液的影响。EGTA浓度为0.8 mmol/L时，可将8 mmol/L钙样品反应液的吸光度降至与空白管一致，而镁、锌、铜、铁反应液的吸光度没有改变。选择EGTA试剂浓度为0.8 mmol/L。
6.EGTA试剂中NaOH浓度的选择：EGTA可以降低应用试剂的吸光度，而应用试剂的吸光度可随pH值的增加而升高。调整EGTA试剂中NaOH浓度至75 mmol/L，EGTA对应用试剂吸光度值的非特异性降低可基本消除。虽然这种吸光度的非特异性下降在零标准校正即空白测定时能够扣除，为尽量减小反应过程中吸光度的非特异性变化，我们选择EGTA试剂中的NaOH浓度为75 mmol/L。
7.干扰试验：样品中下列物质Mg2+2 mmol/L，Fe3+、Fe2+、Zn2+均为0.5 mmol/L，Cu2+ 0.3 mmol/L，总胆红素0.46 mmol/L，血红蛋白15 g/L以及严重脂浊标本对本法均无有意义的干扰。
8.回收试验：血清与水按95∶5和90∶10的比例混合作为基样，与20 mmol/L钙标准液混合作为回收测试样品。测得钙浓度基样为2.185、2.069，回收试样为3.190、4.031，回收率为100.5%和98.1%。平均回收率99.3%。
9.线性试验：试验线性范围0～5 mmol/L。
10.重复性试验：低值批内：n=20，=1.586，s=0.018，CV=1.13%；批间n=10，=1.602，s=0.029，CV=1.81%。高值批内：n=20，=3.036，s=0.017，CV=0.56%；批间：n=10，
