关键词： 分子生物学；聚合酶链反应；念珠菌属

【摘要】目的建立快速鉴别念珠菌的方法。方法以聚合酶链反应对多种念珠菌进行扩增，而后采用单链构象多态性(SSCP)技术对6种念珠菌的扩增产物进行分析。结果所试6种38株念珠菌均扩增出一条685 bp的特异DNA片段，经SSCP分析在聚丙烯酰胺凝胶电泳中不同种念珠菌的SSCP图谱呈明显多态性，能够相互区别。结论该方法灵敏、快速、简便，有助于对念珠菌种的及早确认。

Single-strand conformational polymorphism for recognition of candida species^*Yang Likuan, Zhou Guimin, Xie Ling, et al.^*Clinical Laboratory, Beijing Command General Hospital,Beijing 100700

【Abstract】ObjectiveTo study a method for the rapid recognition of Candida species.MethodsDNAs from Candida species were amplified by PCR,and the amplicon was assayed by single-strand conformational polymorphism (SSCP).ResultsThe tested Candida contained 38 strains of 6 species. A 685bp specific DNA product emerged from them by PCR amplification. The SSCP patterns of 6 Candida species had obvious polymorphism,and were recognized each other.ConclusionThis method was sensitive, rapid and convenient in the early recognition of Candida species.

【Key words】Molecular biologyPolymerase chain reactionCandida

侵袭性念珠菌感染已成为免疫损伤患者高发病率及死亡率的重要因素之一，且不同念珠菌的致病性及耐药性又存在较大差异，因此对念珠菌种的快速识别将有助于临床的早期诊断和选择用药。单链构象多态性(single-strand conformational polymorphism，SSCP)^［1］技术具有灵敏、简便的特点，它利用保守区的序列作为引物，以聚合酶链反应(PCR)进行扩增，利用不同菌间扩增产物微小的碱基差异或构象的不同，其在聚丙烯酰胺凝胶上迁移率亦不同的特点将不同念珠菌彼此区分开。本研究探讨应用SSCP技术对6种临床常见念珠菌进行快速鉴别，报道如下。

材料与方法

一、材料

1.菌株：⑴标准菌株：白色念珠菌AS2.1505、季也蒙念珠菌 AS2.1500，取自中国科学院微生物所；伪热带念珠菌ATCC28838，热带念珠菌 ATCC1463、克柔念珠菌ATCC6258、近平滑念珠菌ATCC22019，取自美国标准菌株保管委员会。⑵实验菌株：共32株，其中白色念珠菌9株，热带念珠菌5株，伪热带念珠菌3株，克柔念珠菌4株，近平滑念珠菌6株，季也蒙念珠菌5株，均由解放军总医院微生物科自临床标本分离，经形态学和生化反应鉴定(VITEK-AMS YBC卡)。

2.主要试剂：N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(TEMED)上海前进试剂厂生产，加样缓冲液(95％甲酰胺，0.5％二甲苯氰醇，0.5％溴酚蓝)本室自制。

3.仪器：DNA热循环仪480，美国PE公司产品；DYY-Ⅲ22A型电泳槽 北京六一仪器厂产品。

二、方法

1.培养：所试念珠菌接种于沙保弱葡萄糖琼脂培养基，35℃培养48小时。

2.引物序列分别为引物1：5′-ACTTTCGATGGTAGGATAG-3′，引物2：5′-ATCGTCTTCGATCCCCTA-3′。真菌DNA提取以及PCR扩增均按文献［2］进行。

3.SSCP分析：分别配制10％、8％、5.8％、5％的聚丙烯酰胺凝胶，其中均加有终浓度分别为过硫酸铵0.06％、甘油1％、TEMED 0.09％。丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺为29∶1。取5 μl扩增产物与5 μl加样缓冲液混合，100℃煮沸5分钟，立即加入凝胶孔。接上电源，于4℃电压150V电泳4小时。凝胶于EB-TBE缓冲液中染色20分钟，以紫外透射仪观察结果。

结果

1.念珠菌扩增结果：所试6种38株念珠菌均扩增出约685 bp的特异DNA片段，结果为阳性。

2.聚丙烯酰胺凝胶浓度的选择：当聚丙烯酰胺凝胶浓度为10％时，电泳图谱显示6种念珠菌均可见两条亮带，彼此间区别不明显；当浓度为8％时所试6种念珠菌除均可见这两条亮带外，热带念珠菌还出现两条中等强度的亮带，由此能与其他念珠菌区别开；当浓度为5％时分离效果也不理想；而以浓度为5.8％时效果最佳(附图)。

m：PCR markers，1：白色念珠菌AS2.1505，2：近平滑念珠菌ATCC22019，3：热带念珠菌ATCC1463，4：伪热带念珠菌ATCC28838，5：克柔念珠菌ATCC6258，6：季也蒙念珠菌AS2.1500

附图5.8%聚丙烯酰胺凝胶上不同念珠菌的SSCP图谱结果

3.念珠菌的SSCP图谱：所试6种念珠菌的SSCP图谱各不相同，在聚丙烯酰胺凝胶上季也蒙念珠菌可见两条高强度的亮带，且能够清晰分辨；而克柔念珠菌则不同，于此位置有3条高强度的亮带；白色念珠菌除这两条亮带外其后还有两条相距很近的中等强度亮带，故据此能够将这3种念珠菌区分开。热带念珠菌与伪热带念珠菌在稍前位置处比上述菌多出两条高强度的亮带，因此可与它们明显鉴别开；其中伪热带念珠菌的这两条带紧密相邻，而热带念珠菌此两带间位置稍远，能清晰分辨，由此可以将之区分。近平滑念珠菌最主要的特点是在突前位置处还有一条亮带，而其他几种念珠菌则无，因此能够予以鉴别(附图)。而且结果显示，同等条件下，所试6种念珠菌中同种念珠菌的SSCP图谱均完全相同，由此表明不同种念珠菌各有其特异的SSCP图谱。

讨论

通过对6种念珠菌的SSCP分析结果表明，一定条件下，在聚丙烯酰胺凝胶上不同种念珠菌所显示的亮带数量及位置等有着明显不同，而同种念珠菌其SSCP图谱则完全一致，因此可以将不同念珠菌彼此区分，同时表明作者所选引物对多种真菌有较好的通用性，而对不同念珠菌又有其特异性。

Walsh等^［1］采用SSCP技术对扩增自多种医学真菌的195 bp的片段进行分析，能够将念珠菌与曲霉菌鉴别开，而3种念珠菌(白色念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌)的SSCP图谱则完全相同。这与本研究的结果不同，由此表明利用SSCP技术检测与鉴别真菌依赖于所扩增的基因或其片段，即应用的引物不同可以有不同深度的鉴别结果。

作者为了达到简便快速鉴别念珠菌的目的，尝试直接对扩增得到的685 bp片段进行SSCP分析，实验中我们通过适当增加聚丙烯酰胺凝胶的自由度及增大滤过孔径，使其对构型改变的敏感性增加，取得了一定效果，所试6种念珠菌彼此间能够区分。但由于SSCP技术对500 bp以内的扩增片段有较高分辨率，而我们所用片段较大，且对SSCP分析产物未用银染色法显色，所用溴化乙啶对单链DNA的亲合力不佳，因此图象不好，变态性不够，尚需改进。

对通用引物的扩增产物进行分析，有人采用限制性核酸内切酶分析或结合特异DNA探针进一步将真菌鉴定到种，取得了明显成效^［3，4］，但其均要求首先对扩增产物进行纯化，且操作较为复杂，耗时较长。SSCP技术虽然在种间分型鉴定上比之略有不足，但由于其鉴别基础是建立于不同念珠菌的核苷酸序列或构象的差异上，因此也同样可靠，而且更为简便、快速，直接将扩增产物加热变性后即可加到凝胶孔中电泳，4～5小时即可得到结果。

应用SSCP技术识别不同念珠菌，可以在24小时内得到明确的结果，有利于对临床上念珠菌感染的早期提示，而且该技术在对其所致感染进行流行病学分析或筛选突变株方面更有意义。

参考文献

1Walsh TJ, Francesconi A, Kasai M, et al. PCR and single-strand conformational Polymorphism for recognition of medically important opportunistic fungi.J Clin Microbiol,1995,33：3216-3220.

2 杨立宽，周贵民，张军民，等.应用聚合酶链反应检测18种46株酵母样真菌的探讨.中华医学检验杂志，1996，19：270-272.

3Hopfer RL,Walden P,Setterquist S,et al. Detection and differentiation of fungi in clinical specimens using polymerase chain reaction(PCR)amplification and restriction enzyme analysis.J Med Vet Mycol,1993,31：65-75.

4Fujita S, Lasker BA, Lott TJ, et al. Microtitration plate enzymeimmunoassay to detect PCR-amplified DNA from candida species in blood. J Clin Microbiol,1995,33：962-967.

(收稿：1997-08-22修回：1998-02-17)