关键词： 肌萎缩；脊髓性；聚合酶链反应；多态性；限制性片段长度

【摘要】目的了解儿童期发作的进行性脊髓性肌萎缩(SMA)患者的运动神经元存活基因(SMN)的缺失，探讨聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术用于检测SMA疾病的诊断价值。方法应用PCR-RFLP技术对10例拟诊为SMA患者、6个家系的20例非SMA成员及30例正常人的SMN基因外显子7和8进行了检测。结果10例SMA可疑患者中9例(90%)有SMN基因缺失，其中仅外显子7或8缺失各为1例。家系其他成员及对照组均无SMN端粒基因缺失。结论用PCR-RFLP法对高度可疑SMA的病例进行诊断，具有较高敏感性和特异性，简便易行。

Diagnosis of progressive spinal muscular atrophy by using polymerase chain reactionYao Juan^*， Ding Xinsheng, Shen Mingjiu, et al. ^*Department of Neurology, First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029

【Abstract 】ObjectiveTo understand the deletion in the survival motor neuron gene (SMN) with childhood-onset spinal muscular atrophy (SMA) in Chinese, and the value of diagnosis in SMA disease by using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) method.Methods Deletions of SMN gene of exon 7 and 8 in 10 cases of presumed SMA, and 20 normal control from 6 families and 30 unrelated controls were performed by PCR-RFLP analysis.Results Deletions of SMN gene were detected in 9 of 10 (90%) cases of presumed SMA, only 1 case lack exon 7 or 8, respectively. No deletions of SMN in the telomeric were found in the other numbers of families and controls.ConclusionIt is sensitive, specific and simple by using PCR-RFLP to diagnose patients who had suspected SMA.

【Key words 】Muscular atrophy, spinalMuscular atrophy, spinalPolymerase chain reactionPolymorphism, Restriction fragment length

儿童期发作的进行性脊髓性肌萎缩症(SMA)是一种常见的常染色体隐性遗传病。新生儿发病率约为1/6 000。此病临床确诊较难，生化缺陷未知，主要靠临床病史、体征及肌电图、肌活检综合诊断。90年代始国外学者通过基因连锁分析确定了SMA全部三型的基因定位于人5号染色体长臂11.2～13.3上^［1～3］。1995年法国和加拿大学者又分别克隆了该区域的两个主要候选基因：运动神经元存活基因(SMN)和神经元凋亡抑制蛋白基因(NAIP)^［4，5］。Lefebvre等^［4］发现98.6%(226/229)SMA患者的SMN基因外显子7和8有缺失或有截断。这类缺失检测可采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)检测。我们建立了错配(mismatch)PCR法，结合限制性片段长度多态性(RFLP)技术，分析国人SMN基因缺失在诊断SMA疾病中的价值，现介绍如下。

材料与方法

一、主要材料

1.试剂：提取DNA试剂盒为美国GENTRA公司产品；Taq酶、dNTP、DNA标准物为复华公司产品；DdeI、DraI内切酶为Premega公司产品。琼脂糖系进口分装。其余试剂为国产分析纯级。对照阳、阴性患者DNA样品系宾夕法尼亚大学惠赠。

2.引物合成：参照文献［4，6］设计。由中国科学院上海细胞生物学研究所合成。外显子7引物：R₁₁₁5′AGACTATCAACTTAATTTCTGATCA3′和错配引物X₇-Dra5′CCTTCCTTCTTTTTGATTTTG3′。外显子8引物：541C₉₆₀5′GTAATAACCAAATGCAATGTGAA3′和541C₁₁₂₀5′CTACAACACCCTTCTCACAG3′。

二、对象

1.10例可疑SMA患者，年龄7个月～14岁。男6例，女4例，其中6例来自6个家庭。按Pearn^［7］诊断标准拟诊。

2.非SMA家系成员20例，均为可疑SMA患者的有血缘关系之亲属，年龄25～66岁，男7例，女13例。正常无血缘关系者30例，年龄10个月～35岁，男17例，女13例。经查均排除了神经系统疾病和其他疾病，每例取EDTA-K₃抗凝全血1 ml备用。

三、方法

1.模板DNA制备：(1)蛋白质沉淀法，按试剂盒说明书进行。(2)NaI法，参照文献［8］取抗凝全血0.5 ml制备DNA。

2.PCR扩增：反应体系为50 μl，含5×buffer，4×dNTP各20 μmol/L；引物均为25 pmol/L，2 U Taq酶。将DNA模板300～500 ng置PCR扩增仪上，94℃预变性5分钟，93.5℃ 30秒，55℃ 1分钟，72℃ 1分钟，35次循环后，72℃延伸7分钟。

3.酶切：PCR产物15 μl，分别用DraI和DdeI酶切，用3%～4%琼脂糖(含1%Nusieve)或8%聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳，溴乙啶染色后，在紫外灯下观察结果。外显子7：DraI酶切后，正常人可有SMNt端产物200 bp带及SMNc端被消化的176 bp区带，或SMNc假基因丢失，仅剩SMNt端产物200 bp带。外显子8：DdeI酶切后，正常人可有SMNt端产物200 bp带和SMNc端被消化片段122 bp及78 bp带，或丢失了SMNc产物仅有SMNt的产物200 bp带。在SMA患者则出现SMNt(200 bp)端粒基因缺失。

结果

1.模板DNA提取方法比较：用两种方法各制备6份DNA模板，PCR扩增后，均能扩增出200 bp片段。扩增产物经酶切后，同一份DNA样品结果完全一致。说明两法均适于PCR-RFLP。

2.10例拟诊为SMA患者中，7例外显子7和8的SMNt等位缺失，而仅外显子7缺失和仅外显子8缺失者各1例。在正常对照30例及20例非SMA家系成员中，各1例有SMNc端粒丢失(假基因丢失占4%)。

讨论

国外学者为了寻找SMA疾病的候选基因，自1990年起相继构建了一系列覆盖了SMA致病位点的人工酵母染色体重叠群(YAC contig)，通过筛查到的一些微卫星又进一步发现了SMA致病基因定位于人5号染色体长臂1区上。此区域有一约500 kb的反向重复序列，其端粒处有约20 kb的基因与SMA密切相关。在目前发现的SMA相关基因(SMN和NAIP)中SMN被称之为SMA决定基因，有8个外显子。国外学者测序证实，SMN基因及其侧翼有5种差异。外显子7上有同义突变(编码280；TTC，端粒；TTT，着丝粒)，在外显子8上有3′非编码区域改变(核苷酸1155；TTG，端粒；TGA，着丝粒)，以及内含子6和7上有三个单碱基替代物。以上SMN反向重复序列差异的鉴别及对SMA疾病的诊断，最近已开始采用更易鉴别的PCR-RFLP法和DNA-酶免疫方法^［9］。

本研究所采用的错配PCR-RFLP法，已知SMN基因的外显子8之端粒无DdeI酶切位点，但其着丝粒上有此位点，可通过酶切鉴别其PCR产物。而外显子7，虽有单核苷酸差异，但无现成酶切位点，通过人为错配的1个寡核苷酸附着在外显子7引物的3′末端，使cDNA的875位置上有A＞G的置换，从而创造了1个DraI酶切位点在PCR产物中。这样SMNt和SMNc端可以通过PCR-RFLP来鉴别。

国外有关SMN基因缺失，阳性率在92.0%～98.6%左右；且95.5%正常人均有SMNc拷贝(即尚有4.5%左右正常人丢失SMNc假基因)。本组拟诊SMA的10例中，9例有端粒SMN基因等位缺失，而正常对照组及非SMA家系成员均无SMN缺失，仅有2例有SMNc基因丢失(占4%)，与国外报道相似。证明此法敏感、特异。1例拟诊SMA患者无SMN基因缺失，考虑可能有其他突变或诊断有误。2例拟诊SMA的患者仅有外显子7或8缺失，提示对于高度可疑SMA患者，检测出SMN基因两种外显子中任一种缺失，即可帮助确诊为SMA。国外报道对高度可疑SMA而SMNt基因无缺失患者，采用基因连锁分析可使诊断阳性率提高到99%以上。

我们认为，DNA制备是试验成功的关键。本研究中两种DNA制备法均摒弃了经典的饱和酚试剂。DNA提取药盒简便易行，效果佳，但成本高于NaI法。NaI法试剂易得，较经济，适于基层开展。两法均只取较少全血，适于婴幼儿。对部分样品，我们采用了二次PCR扩增，结果更敏感，且可籍此保留家系中更多的DNA样品。

对临床高度怀疑为SMA的患儿，可用本法协助SMA确诊。本法敏感、快速、可靠、特异性强，结果较PCR-SSCP更易辨别。

志谢本组部分病例由解放军总医院沈定国教授、李宁医师提供；本工作曾得到美国宾西法尼亚大学医院Dr Leonard、本院潘世扬、倪黎的热忱支持，特此一并致谢

参考文献

1Brzustowicz LM, Lehner T, Castilla LH, et al. Childhood-onset spinal muscular atrophy to chromosome 5q11.2-13.3. Nature, 1990, 344:540-541.

2Melki J, Burlet P, Clermont O, et al. Refined linkage map of chromosome 5 in the region of the spinal muscular atrophy gene. Genomics, 1993, 15:521-524.

3Melki J, Lefebvre S, Burglen L, et al. De Novo and inherited Deletion of the 5q13 region in spinal muscular atrophies. Science, 1994, 264:1474-1477.

4Lefebvre S, Burglen L, Reboullet S,