关键词： 聚合酶链反应；端粒酶；肿瘤细胞；培养的

【摘要】目的比较聚合酶链反应-酶免法（PCR-ELISA）和聚合酶链反应-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PCR-PAGE）方法检测白血病细胞端粒酶活性的临床应用价值。方法PCR-ELISA以地高辛标记对端粒重复片段特异的探针与PCR变性产物杂交，通过ELISA系统检；PCR-PAGE方法直接用电泳法分离PCR扩增端粒酶的合成产物，经溴乙啶染色，分析端粒酶活性。结果PCR-ELISA方法能准确特异地检测白血病细胞的端粒酶活性，检测灵敏度可达1×10²细胞数。经PAGE分离显示，端粒酶的PCR产物有含50 bp等6条梯带。结论两种方法均可用于临床检测。PCR-ELISA方法似更简单、方便一些。

Polymerase chain reaction determing telomerase activity in cell linesZhang Liping^*, Jiang Jikai, Liu Xiangxui, et al. ^*Second Hospital ,Affiliated to Chongqing University of Medical Science, Chongqing 400010

【Abstract】ObjectiveTo detect telomerase activity in cells by PCR-ELISA and PCR-PAGE.MethodsWe used telomerase PCR ELISA an assay in which a digoxigenin-labeled telomerase repeat-specific probe is hybridized to the PCR product detecting with ELISA. Telomerase activity was analyzed by PAGE.ResultsTelomerase activity was determined by PCR-ELISA accuratly and specifically in leukemia cells. The sensitivity of the telomerase PCR-ELISA was 1×10² cells. A ladder of PCR products with 6 bp increments starting at 50 nucleotides ( i.e. 50, 56, 62, 68, etc) was seen by PAGE.ConclusionPCR-ELISA method is ideal for analyzing telomerase activity in leukemia cells and tumor cells. It is simple, easy, sensitive and specific, and is more suitable for clinical application.

【Key words】Polymerase chain reactionTelomeraseTumor cells, ultured

端粒(telomere)是真核细胞染色体末端的特殊DNA-蛋白质结构，其作用是保护和稳定染色体末端。端粒DNA的特点是含有大量串联并富含G（TTAGGG）的重复序列^［1］。由于DNA聚合酶不能复制线性DNA的最末端，所以在普通的体细胞中，端粒的末端会随周期性的复制被逐渐缩短。研究提示端粒DNA的长度与细胞的寿命，或细胞癌化密切相关^［2］。有证据表明端粒DNA由端粒酶（telomerase)以独特的方式合成，且已在许多肿瘤细胞中检测到该酶的活性^［3］。端粒酶使肿瘤细胞无限制复制增殖的特点，成为目前肿瘤学研究的一大主题。有学者提出端粒酶可能是抗肿瘤治疗的一个新的靶点。因此，对组织或细胞内的端粒酶活性的检测及其意义已日益受到临床的高度重视。我们采用聚合酶链反应-酶联免疫吸附法（PCR-ELISA）和聚合酶链反应-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PCR-PAGE），检测了细胞内的端粒酶活性，现报告如下。

材料和方法

一、标本来源

细胞培养：人红白血病细胞株K-562，人早幼粒白血病细胞HL-60细胞株，肝癌细胞株HepG₂和肺成纤维母细胞株（IMR90）。采用常规培养。培养液为含10%小牛血清，青、链霉素各10万U/L的RPMI-1640，在37℃，饱和湿度，5%CO₂孵箱中培养，每3～4天换液传代培养。

二、主要试剂

1.端粒酶PCR-ELISA检测用主要试剂购自德国宝灵曼公司。

2.端粒酶PCR-PAGE检测用主要试剂由香港大学生物化学系惠赠。

3.RN ase A和无菌DEPC水由本研究室自备。

三、端粒酶活性检测方法

1.PCR-ELISA测定原理：端粒酶自带模板将端粒重复片段（TTAGGG）加到生物素标记、人工合成的P1-TS-引物的3′端，经PCR反复扩增P1-TS和P2引物间的特异产物，产生含有端粒酶特异的六核苷酸重复序列的PCR产物。将PCR产物变性后，与地高辛标记，并对端粒重复片段特异的探针杂交，杂交产物通过生物素标记的引物固定在抗生物素蛋白包被的微孔板上。之后用与过氧化物酶结合的抗地高辛抗体（Anti-DIG-POD）检测经固定的PCR产物。最后加入过氧化物酶的反应底物TMB便可产生一着色反应产物。

2.端粒酶提取：收集对数生长期细胞，调节细胞数为1×10⁵/ml 左右，置37℃，5%CO₂培养5天。收集细胞，调整细胞数为1×10⁶/ml，置4℃，3 000 g，离心10分钟，弃去上清液，用PBS重悬细胞，重复离心。弃去上清液，加入200 μl裂解剂（5%CHAPS），冰浴30分钟，40℃，16 000 g，离心20分钟，小心移上清液于用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的离心管，-80℃冻存提取液备用。

3.RT-PCR扩增：(1)引物延伸：将上述提取液2 μl，置25℃，30分钟，循环1次；(2)端粒酶灭活：94℃，5分钟，循环1次；(3)PCR扩增：50 μl反应体系，包括dNTP、Taq酶、生物素标记的引物Ⅰ和引物Ⅱ，置94℃30秒，50℃30秒，72℃90秒，循环30次；(4)平衡：置72℃，10分钟。

4.扩增产物检测（核酸与蛋白连接系统）：5 μl PCR扩增产物，20 μl变性试剂，室温下孵育10分钟，加入225 μl杂交混合液（含地高辛标记的检测探针DIG-labeled probe )，充分混匀后，加入100 μl混合液于抗生物素蛋白包被的微孔板上。之后加入抗体（anti-DIG-POD）100 μl，18～22℃、30分钟。最后加100 μl POD的底物TMB显色10分钟，加终止液终止反应，测定450 nm和690 nm的吸光度（A）值。根据A=A₄₅₀-A₆₉₀计算。

四、端粒酶PCR-PAGE检测

1.测定原理：根据端粒酶在TS引物（5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′）末端添加端粒重复片段（TTAGGG）而延长产物，然后用PCR扩增延长产物，即可产生从50 bp开始（50、56、62、68 bp等）的端粒酶特异的6 bp的梯阶片段。经非变性PAGE观察各梯带，了解端粒酶活性。

2.端粒酶提取同上。

3.RT-PCR扩增：50 μl反应体系。逆转录30℃、30分钟；PCR扩增逆转录产物，94℃、30秒，60℃、30秒，循环35～40次。

4.扩增产物检测：将扩增产物在15%的PAGE，400 V， 40分钟，0.5× TBE缓冲液，溴乙啶染色即可产生6 bp的梯阶片段。

结果

1.端粒酶PCR-ELISA方法的特异性检测结果如图1 所示，只有端粒酶阳性细胞株K-562和HL-60显示阳性，端粒酶活性较高（A值分别为0.898、0.606），而端粒酶阴性细胞株IMR90显示阴性（A值为0.112)。

用端粒酶PCR-ELISA检测K-562细胞和HL-60细胞的端粒酶活性K-562：端粒酶阳性细胞株：HL-60：端粒酶阳性细胞株IMR90：端粒酶阴性细胞株

阴性对照：不含提取物的裂解剂(Lysis)，用以监测是否有PCR污染；RNaseA：用以灭活端粒酶的RNA模板，作检测样本的自身对照热灭活：用以灭活端粒酶的蛋白质，作检测样本的自身对照 tSR8：质控模板，阳性对照，用以相对定量

图1细胞株中端粒酶活性的特异性

2.端粒酶PCR-ELISA 的灵敏度如图2。由图形显示端粒酶PCR-ELISA方法可以检测1×10²细胞数的端粒酶活性。

3.端粒酶PCR-PAGE检测结果如图3所示，K-562细胞有高端粒酶活性，出现从50 bp开始的6条条带（50、56、62、68、74、80 bp）。

讨论

端粒酶是近年来发现的一种独特的DNA聚合酶，以其自身携带含RNA模板而区别于一般的纯蛋白逆转录DNA聚合酶。它的活性是在染色体的末端添加TTAGGG，以弥补端粒的丢失而使细胞无限增殖。其在肿瘤诊断和治疗中的地位日益突出。大

端粒酶阳性K-562细胞提取液用裂解液作系列稀释，图中所示的包括经RNase处理(+RNaseA)和未经RNase处理(-RNaseA)的提取物的实验结果

图2端粒酶PCR-ELISA的灵敏度

1：Lysis：阴性对照；2：TSR8：阳性对照；3：未经作用的K562细胞，显示6条清晰的DNA片段(相差(6 bp)；4：+RNaseA：以破坏其RNA成分，自身对照；5：肝癌细胞株HepG2，显示3条DNA片段；6：阴性细胞株IMR90

图3PCR-PAGE分离K562细胞的端粒酶活性

量的文献报道在肿瘤细胞和大多数细胞系中检测到端粒酶活性，而在普通的体细胞中则没有端粒酶的表达^［4］，提示端粒酶的重新活化可能是体细胞发生恶性肿瘤的条件之一，使<