关键词： 巨细胞病毒；mRNA；聚合酶链反应

【摘要】目的建立快速简便的逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测人巨细胞病毒(HCMV)即刻早期(IE)基因mRNA。方法设计合成跨越HCMV IE基因内含子区的一对引物，分别用RT-PCR和PCR技术扩增HCMV mRNA和DNA，用Southern杂交鉴定阳性产物。结果HCMV IE基因mRNA表达在感染后6小时即可出现，并持续到感染后至少96小时，RT-PCR检测的最低敏感性为100 fg总RNA，其他病毒和细胞RNA不能被扩增。结论RT-PCR技术检测HCMV mRNA敏感、特异，有望应用于临床作为HCMV活动性感染的早期诊断方法。

The development of a method for the detection of mRNA from human cytomegalovirus immediate early geneShi Jinyang, Jin Hong, Gao Hong, et al. Virus Lab, 2nd Hospital, China Medical University, Key Lab of Congenital Malformation of Public Health Ministry, Shenyang 110003

【Abstract】ObjectiveTo develop a rapid and simple method of reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) for the detection of mRNA from human cytomegalovirus (HCMV) immediate early (IE) gene.MethodsWe designed and synthesized a pair of primers located in two HCMV exons. IE gene mRNA and DNA were detected by RT-PCR PCR separately and the positive products were identified by Southern blot.ResultsmRNA from HCMV IE gene was detected as early as 6 hours after infection and still existed in the cells for 96 hours after infection. 100 fg RNA from infected cells gave expected bands by RT-PCR, mRNA from other virus, and cells were negative.ConclusionThe method of RT-PCR is sensitive and specific. It can be applied in clinics for rapid diagnosis of HCMV active infection.

【Key words】CytomegalovirusmRNAPolymerase chain reaction

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)感染可引起小儿先天性疾病，潜伏感染激活可成为免疫缺陷和器官移植患者的致死性因素。聚合酶链反应(PCR)技术由于其较高的灵敏性而被广泛应用于HCMV的临床诊断^［1］，但无症状或潜伏感染者的病毒DNA均可呈阳性反应，为此我们建立了用以检测HCMV复制阶段产生的即刻早期(immediate early，IE)基因转录物mRNA的逆转录PCR(RT-PCR)方法，可辅助早期诊断HCMV活动感染，报道如下。

材料和方法

1.细胞培养和病毒接种：原代人胚肺纤维母细胞、Hela细胞由本室传代培养，HCMV AD169株、单纯疱疹病毒(HSV)Ⅰ型、Ⅱ型为本室保存株。人胚肺成纤维细胞长成单层后接种HCMV AD169株，感染后2、6、24、96小时收获感染细胞，于冷PBS中清洗2次，待提取总RNA和DNA。

2.总RNA和DNA提取：用传统的氯化铯梯度离心法^［2］和异硫氰酸胍一步法^［3］分别提取总RNA，用常规酚氯仿方法抽提DNA。在紫外分光光度计(Shimadzu UV-1201)下测得吸光度A₂₆₀和A₂₈₀值，计算提取物浓度。

3.引物和探针的设计合成及探针标记：根据Sternberg等^［4］报道的HCMV AD169序列，分别设计HCMV IE基因的一对引物和探针。此对引物位于HCMV IE基因第3、4外显子，跨越长155 bp的内含子，这样mRNA和DNA产物长度分别为260和415 bp。探针为HCMV第3、4外显子的部分序列，不包括内含子，故只与RT-PCR扩增产物杂交。引物和探针由上海细胞生物学研究所合成，序列如下：IE1(334～353)：5′TTTGAACGAGTGACCGAGGA3′；IE2(550～569)：5′CCCAATACACTTCATCTCCT3′；探针(387～416)：5′GAACTCGTCAAACAGATTAAGGTTC-GAGTG3′。

取合成的寡核苷酸探针0.1 μg(1 μl)，加入T₄多核苷酸激酶8 U(0.8 μl)，γ-³²P dATP50 μci(5 μl)，10×buffer 5 μl，用重蒸馏水补至50 μl，37℃温育30分钟完成标记反应。经Sephadex G-50柱层析分离标记探针和未标记的dNTP，收集探针作杂交反应。

4.逆转录合成cDNA第一链：反应总体积为20 μl。总RNA 0.1～0.4 μg加入互补于3′端的下游特异引物50 pmol，20 U RNasin，1 mmol/L dNTPs，7 U AMV，42℃60分钟，最后95℃ 5分钟灭活逆转录酶。

5.PCR扩增：反应总体积为20 μl。3 μl逆转录后的cDNA和提取的DNA用于PCR反应，PCR扩增仪为美国PE 480型，程序：94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，35个循环后，再72℃5分钟一次。

6.产物分析和Southern印迹：于2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色后紫外灯下观察RT-PCR和PCR扩增产物。凝胶经变性液(1.5 mol/L NaCl，0.5 mol/L NaOH)浸泡45分钟使DNA变性，中和液(0.5 mol/L TrisHCl，1.5 mol/L NaCl pH7.5)作用30分钟，再通过Southern转印至尼龙膜上，80℃干烤固定2小时。用放射同位素³²P末端标记的寡核苷酸探针与之杂交，洗膜后，-70℃放射自显影48小时。

结果

1.不同感染时间HCMV IE基因表达：HCMV mRNA和DNA产物长度分别为260和415 bp。每个提取的总RNA标本都在RT-PCR同时设PCR对照，这些标本始终无DNA产物出现，表明RNA提取中的DNA靶顺序未产生足以与cDNA靶顺序相竞争的扩增。IE基因编码的转录物于培养6小时可检出，并至少持续96小时，2小时未能检出(图1)。感染后6小时的产物同时提取DNA并行PCR扩增，结果阴性。异硫氰酸胍一步法与氯化铯梯度离心法提取RNA的RT-PCR结果无明显差异(图2A)。

2.特异性和敏感性：RT-PCR和PCR扩增产物片段与预先引物设计结果相符，且电泳观察无非特异扩增条带，RT-PCR扩增产物与特异寡核苷酸探针杂交呈阳性反应，与PCR扩增的DNA产物杂交呈阴性结果(图2)。HSV-Ⅰ、HSV-Ⅱ及未感染的人胚肺细胞总RNA的RT-PCR结果为阴性。系列稀释的

1，2：RT-PCR扩增HSV-1、HSV-2；3，5，7：RT-PCR扩增HCMV mRNA(260bp)3(96h)，5(24h)，7(6h)；4：Markerφx174/HaeⅢ；6，8：PCR扩增HCMV总RNA(表明没有与cDNA竞争的DNA靶顺序)；9：PCR扩增HCMV DNA(415 bp)；10：阴性对照

图1RT-PCR检测HCMV mRNA结果

a：RT-PCR检测HCMV mRNA结果。A₁，A₇：PCR扩增HCMV DNA(415 bp)，A₇为6小时结果；A₂：阴性对照；A₃：PCR扩增HCMV总RNA(表明没有与cDNA竞争的DNA靶顺序)；A₄～A₆：RT-PCR扩增HCMV mRNA(260 bp)，A₄、A₅为异硫氰酸胍一步法提取RNA，A₆为氯化铯梯度离心法提取RNA；A₈：Markerφx174/HaeⅢ

b：Southern印迹的放射自显影(48 h)结果。B₁：PCR扩增HCMV DNA无杂交带；B₄～B₆：RT-PCR扩增HCMV mRNA有杂交带

图2RT-PCR检测HCMV mRNA及Southern印迹的放射自显影结果RNA经反转录和PCR扩增后提示，RT-PCR最低可检出100 fg总RNA(图3)。

1：RT-PCR扩增人胚肺细胞总RNA；2，3：RT-PCR扩增HSV-1，HSV-2；4：PCR扩增HCMV总RNA(表明没有与cDNA竞争的DNA靶顺序)；5：阴性对照；6：Markerφx174/HaeⅢ；7～10：HCMV总RNA分别为100 fg、1 pg、10 pg、100pg

图3RT-PCR敏感性和特异性

讨论

目前，PCR技术已广泛应用于HCMV感染的诊断。Sternberg等^［4］研究表明HCMV即刻早期蛋白是分子量为72 000的非结构性蛋白，其编码基因位于HCMV长独特区，此蛋白合成出现于HCMV DNA合成之前，并启动HCMV基因表达，病毒感染数小时后可被检出，故检测IE基因能达到早期诊断目的。因mRNA为病毒基因转录的产物，是复制活跃的标志，因此mRNA表达与活动性感染关系密切。国外已有用RT-PCR技术检测IE基因的mRNA早期诊断活动感染的研究报道^［5］。

我们设计合成的HCMV IE基因的一对引物跨越一个长155 bp的内含子，使RT-PCR和PCR产物长度有所不同，探针位于两个不同的外显子，只能与RT-PCR扩增产物杂交，证实了产物的特异性。HCMV感染细胞前6小时我们未能检出IE基因mRNA，可能此时IE转录物尚未出现，96小时后因培养的感染细胞大部分脱落，且已出现晚期基因转录物，我们未再检测。HCMV IE mRNA最早于6小时检出，而同时进行的DNA提取和PCR扩增结果为阴性，提示IE mRNA检测有早期意义。本实验过程中严格控制了RNase污染，并证明RT-PCR反应中的RNA模板没有足以与cDNA靶顺序相竞争的DNA靶顺序。采用异硫氰酸胍一步法提取总RNA