静脉血栓形成(venous thrombosis, VT)病因复杂，常因外科手术、骨折、炎症、妊娠及口服避孕药等时发生。虽已确认遗传因素在其发生中具有重要作用，但由蛋白C(PC)、蛋白S(PS)和抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)等遗传缺陷所引起的仅占5%～10%。近来研究发现，活化蛋白C抵抗(activated protein C resistance, APCR)与VT发病密切相关，是目前人们所发现的发生率最高的VT危险因子(占40%～60%)。90%以上的血栓形成患者，其APCR现象是由于凝血因子V(FV)基因的单个点突变所致^［1～3］。作者主要就APCR现象及产生机制，APCR的实验室检测及其临床意义作一综述。

一、APCR现象及产生机制

1.活化的蛋白C(APC)生理功能：PC是一种维生素K依赖性血浆蛋白，在活化状态下其具有抗凝活性，且需依赖凝血酶参与。在凝血过程中产生的凝血酶可与未受损血管内皮细胞上受体之一凝血调节蛋白(thrombomodulin, TM)结合，从而激活PC，这一作用是未结合TM凝血酶激活PC的20 000倍^［4］。另一方面，凝血酶除激活血小板及将纤维蛋白原转变为纤维蛋白外，还通过激活V因子(FV)与Ⅷ因子(FⅧ)变为FVa与FⅧa，FVa与FⅧa可通过激活FX与凝血酶原，促进血凝形成。APC在辅因子PS协同下，可切割和灭活磷脂表面的FVa与FⅧa，从而抑制血凝形成^［3，4］。

2.APCR产生机制：1993年瑞典学者Dahlbck等^［2］研究家族性血栓形成倾向病因时发现，正常情况下，血浆中如果加入APC，由于APC裂解FVa和FⅧa，活化的部分凝血活酶时间(APTT)应延长。但在一例反复发生VT的中年患者血浆中加入APC后未见APTT延长，其19例家系成员中14例有类似结果。这说明这些患者血浆对APC抗凝反应低下，此即APCR现象，可能涉及到某种遗传因素改变。随后，Dahlbck等^［5］进一步从正常血浆纯化得到FV，发现FV能纠正APC-APTT缩短，而从APCR患者血浆分离纯化的FV，无纠正APC-APTT试验异常能力。这提示正常FV可能和PS一样，能成为APC的辅因子，其抗凝功能的选择性缺陷可能成为VT的主要因素。1994年荷兰Leiden大学研究人员发现，APCR发生的分子基础是FV基因的单个位点突变(核苷酸序列第1 691位G→A)导致FV分子氨基酸序列第506位Arg(R)→Gln(Q)(FV R506Q)。该突变亦称FV Leiden突变(以发现者城市荷兰Leiden命名)^［6］。现已证实它以自显性基因遗传方式遗传。因为506位的Arg恰好为APC灭活FVa的切割位点，故在APTT试验时，含Leiden突变的FVa对外源性APC产生抵抗而使APTT(加APC)不能足量延长，而表现为APCR现象^{［3～5，7］}。突变的FVa虽保持着促凝活性，但对APC的裂解作用的敏感性大大降低。凝血酶形成速度加快，又反馈性激活FV、FⅧ。凝血途径活化加速，伴降解FⅧa的APC辅因子活性降低，APCR作用增强，导致高凝状态形成^［3，6］。

二、APCR的实验室检测

(一)筛选试验

常用APC-APTT法作为筛选APCR方法。此法以标准APTT试验为基础，通过检测受检血浆加与不加APC血浆APTT的比值求得。量化指标用APC比率(APC ratio)^［3］或APC敏感率(APC-SR)^［7］表示。公式为APC-ratio(或SR)=APTT(加APC)值/APTT(不加APC)值。

检测过程中应注意下述几点对结果的影响^{［3，8，9］}。(1)标本处理：室温下2 000×g离心20分钟可避免血小板的冷激活，分离血浆必须保证除去血小板，因为即使有不及正常血小板数1%的污染，会使APC比率大为降低。对于冻存复溶血浆标本尤为重要。此法既可用新鲜血浆也可用冻存血浆，但都应在各自相似条件下建立相应参考值范围。(2)APTT试剂与APC：由于不同试剂及混杂在试剂中激活剂的类型不同都大大影响APTT结果，APTT试剂对APC反应敏感性及所用APC质量与浓度不同也可导致结果不一，所以要特别注意APTT试剂、APC质量和操作准确性。(3)正常对照血浆选取：由于APCR在普通人群中发生率较高(可达10%)，而且有基因缺陷的纯合子或杂合子基因型的人群可不表现任何症状，故相当一部分APCR个体极有可能被认为是正常个体。这当然会极大地影响APCR临界值的确定。最理想的方法是通过DNA分析获取正常FV基因型个体血浆，但这在许多实验室尚无法进行。Dahlbck等^［3］建议除去一些极端APC比率，如10%的极高比率及10%的极低比率的血浆标本。

目前常用试剂盒内多含有APTT试剂、CaCl₂及混有APC的CaCl₂。APC比率≥2视为正常(通常为2.0～5.0)，APC比率＜2视为APCR阳性^［6］。由于可用仪器自动检测，故能排除一些影响结果的人为因素，使结果更为可靠。采用标准化APC比率或敏感率(n-APC-SR)使APCR结果能在各实验室间进行比较^［3，7］。该法需选择一组健康个体混合血浆作为正常对照血浆，测定其APC比率。n-APC-SR通过用患者APC-SR除以正常对照血浆APC-SR求得。公式为n-APC-SR=标本APC-SR/混合血浆APC-SR。应用此法，可校正因试剂不同来源，不同批号及不同检测条件所引起的实验误差，使APCR检测准确性更高。Legnani等^［8］研究了216例VT患者和70例正常人，n-APC-SR参考值为1.06±0.19，范围0.68～1.54。n-APC-SR≤0.68视为异常。

此类方法简便快速，适用于大规模人群筛选。但对于口服抗凝药物(如华法令)，肝素治疗或使用狼疮抗凝物质患者，其血浆APTT延长，无法用这类方法检测APCR存在。可使用下述一些改良方法进行检测。

(二)APTT延长者APCR的检测

1.加缺乏FV血浆稀释法：应用缺乏FV的血浆预先稀释患者血浆，由于加入的缺乏FV血浆可给血浆在正常范围内凝固(APTT正常)提供足够的因子水平(尤其是FⅧ水平)。操作中包括将患者血浆与缺乏FV血浆1∶4混合稀释后测定APTT，其余同上法类似计算APC比率。可应用于口服抗凝药物及肝素治疗患者因FV R506Q突变所致APCR，此法敏感性与特异性较APC-APTT也大大提高^［9］。缺点是易受所用缺乏FV血浆来源的影响，更换新的批号缺乏FV血浆时应重新建立临界值或使用混合缺乏FV血浆。

2.应用凝血酶原时间(PT)法测定FV：此法基于一期法测定FV，用组织因子(TF)活化，用加或不加APC的CaCl₂协助凝固。采用人免疫吸附缺乏FV血浆作为底物，所用组织促凝血酶原激酶(thromboplastin)(即FⅧ)不含钙。加或不加APC血浆凝固时间长短可依据正常混合血浆不同稀释度(横轴)与相应凝固时间(纵轴)在对数坐标纸上(log-log paper)描出曲线图求出。患者血浆在两个稀释度及确定的FV浓度下进行测定，比较相应FV水平下凝固时间的不同。杂合子FV R506Q个体明显偏离正常曲线^［10］。在所研究的39例标本中，37例正常FV表型个体，其凝固时间紧靠回归线分布。该试验对使用狼疮抗凝物质等抗凝治疗患者APCR检测均适用。

近来Le等^［11］将此法加以改良，应用商品化含钙组织促凝血酶原激酶试剂，通过用凝固时间的观察值与预期值的比率(Obs/Exp)来表达试验结果。比较72例Obs/Exp比率与DNA分析结果发现比率为0.6时可区分正常人与FV R506Q杂合子而无重迭，3例杂合子比率小于0.1。此法简便快速，所需标本极少，可进行成批分析，可根据所选用含钙组织促凝血酶原激酶不同将方法进行标准化，应用此法可正确区分正常与FV R506Q杂合子突变而几乎可不需进行繁琐DNA分析。

3.发色底物法：Varadi等^［12］认为APC-APTT法检测APCR，无法了解APTT延长者凝血早期的一些因子的活性情况。为克服此缺陷，可先将待检血浆以一定比例稀释，再加入磷脂、FⅨa、FⅩ和适当浓度APC一起孵育，最后加入FⅩa的作用底物，测得不加与加APC时底物显色值(405 nm)，并以其比值作为APCR指标。由于APC可加强对FⅧa灭活作用，从而限制了FⅩa形成，通过检测FⅩa酰胺水解活力(amidolytic activity)间接反映APC抗凝反应能力。作者报道24例中有23例携带FV R506Q的VT患者用此法测得APC-SR与APC-APTT法检测结果一致。此法不受口服抗凝药物或凝血因子改变等影响。

(三)DNA分析

人FV基因位于第1号染色体长臂(1q21～25)，第1 691位核苷酸位于近外显子10与内含子的交界处。运用分子生物学技术对APCR阳性患者进一步作FV基因分析发现，同时伴FV R506Q突变的可达83%^［7］或100%^［13］，FV基因的1 691G→A点突变与APCR表型存在共分离现象。最常用FV基因分析方法为PCR-RFLP法，即应用PCR技术对上述FV基因1 691位核苷酸片段进行特异性扩增，扩增产物用限制性内切酶消化，通过观察酶切后电泳图谱，便可判断FV R506Q突变存在与否。此外，PCR产物亦可进行测序，以证实PCR产物及酶切产物特异性。

三、APCR检测的临床意义

研究表明，先天性或家族性VT患者中约有20%～60%是由于FV基因突变所致，其APCR呈阳性。FV R506Q杂合子发生血栓形成的机率较正常高5～10倍，缺失基因的纯合子则高50～100倍^［3］。但这些个体可能永不发生血栓形成，除非同时携带其他遗传缺陷，如AT-Ⅲ、PC、PS缺陷或抑制狼疮抗凝物。口服避孕药的妇女可能会诱导获得性APCR，但其与FV基因突变无关^［14］。因此，FV突变个体当其口服避孕药时，由于破坏了APC敏感性而导致血栓形成危险性增加，其机制尚不明确。另外，亦有一些偶然获