免疫层析是出现于80年代初期的一种独特的免疫分析方式^［1，2］，它往往以条状纤维层析材料为固相，通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，并同时使样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体(如抗体或抗原)发生高特异高亲和性的免疫反应，层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域（检测带），通过酶反应或直接运用可目测的标记物（如胶体金）而得到直观的实验现象(如显色)。而游离标记物则越过检测带，达到与结合标记物自动分离之目的。这种分析技术操作简单快速，分析结果清楚，易于判断，且无须仪器(或只需简单仪器)，因此，非常适用于各级医院、家庭或个人在诊断、保健、体检等方面的运用。

一、免疫层析分析原理和运用方式

按照检测原理和运用方式的不同，可将免疫层析分成两个系统:一个是Syntex公司推出的商品名为Acculevel的免疫层析法^［2］，以酶反应显色为基础，主要用于茶碱、吗啡、苯巴比妥等小分子药物的检测。另一个是复合型免疫层析法^［1］，往往以金胶粒或着色乳胶粒等有色粒子作标记物，层析条通过多种材料复合而成。这种层析方法适应面广，可用于多种小分子半抗原和大分子蛋白类物质的检测。

1.Acculevel免疫层析分析：以茶碱的检测为例^［2］。Acculevel层析分析主要包括了三种试剂: 包被有茶碱抗体的试纸条、含有葡萄糖氧化酶和茶碱-牛血清白蛋白-辣根过氧化物酶复合物（茶碱-BSA-HRP）的反应溶液、含有葡萄糖和4-氯-1-萘酚的底物显色溶液。其中的酶反应如下：

葡萄糖+O₂( 葡萄糖氧化酶 )/()→葡糖酸盐+H₂O₂

H₂O₂+4-氯-1-萘酚(过氧化物酶)/()→H₂O+显色物质

Acculevel层析分析的操作步骤：在含有葡萄糖氧化酶和茶碱-BSA-HRP的溶液中加入待测样（全血或血浆），将试纸条下端置于溶液中，溶液中的茶碱-BSA-HRP、茶碱、葡萄糖氧化酶均在毛细作用下向上泳动，同时，溶液中的茶碱和茶碱-BSA-HRP与纸条上抗体发生免疫反应，当溶液迁移到试纸条上端后，加底物进行显色，纸条上颜色的高度与样品中茶碱的浓度呈正相关。上述整个过程约10分钟。

在Acculevel 试验中，颜色的高度可用比移度（R_f)表示。若将R_f定义为待测抗原上行距离与溶液上行距离的比值，则下述关系近似成立：

R_f=(［Ag₀］)/(［Ag₀］+［Ab₀］)

式中［Ab₀］为固定在纸条上的抗体量，［Ag₀］为待测抗原(如茶碱)的量

上式表明，低的抗体固定量和高的抗原浓度使层析条显色高度增加。因此，可根据待测物浓度合理设定抗体包被量。同时，待测物检测下限与抗体包被量相关，若要获得高灵敏度，在保证包被抗体与反应膜牢固联接的条件下，在考虑到检测范围的同时，应尽量减少抗体包被量。

以Acculevel试验对小分子半抗原如茶碱作定量测量具有与酶放大免疫测量（EMIT）相似的准确性、精密性和灵敏度，但其简单、快速、无须仪器的特点却是EMIT法所不具备的。而且，由于待测物的定量是以试纸条上的颜色高度为依据，而不以酶活性为依据，故其测量结果基本上不受酶稳定性以及样品基质(matrix)、pH值、温育时间和温度等环境因素的影响，具有很好的重现性。

2.复合型免疫层析分析：目前市售的大多数免疫层析产品均属于这种类型。同Acculevel免疫层析相比，复合型免疫层析固相材料往往以玻璃纤维膜、硝化纤维素膜、吸水纸等多种材料复合而成，而不是采用单一的试剂条。其受体(抗体、链亲合素等)往往以点或线的形式包被于检测带，而不是包被整个层析条，并且层析条上往往还吸附有干态的可快速溶解并具有良好层析特性的标记或非标记抗体。复合型免疫层析检测也以层析过程中高特异性免疫反应为基础，但其对分析结果的判断是以受体包被的检测带是否显色，而不是以色带高度为依据。

复合型免疫层析法一般采用下述四种方式(附图)。

图A中检测带为抗体1-待测物-金标抗体2；图B中检测带为链亲合素-生物素化抗体2-待测物-金标抗体1；图C中检测带为pAb1-待测物-mAb2-金标抗体2；图D中检测带为抗体1-待测物-金标抗体2

附图复合型免疫层析法的四种常见方式

方式A是复合型免疫层析的常用方式。以尿人绒毛膜促性腺激素（HCG）的检测为例: 方式A中抗体1与抗体2分别对应两株配对性良好的抗HCG mAb1和mAb2。检测时，加样区的尿样在毛细作用下向上泳动，首先溶解金标抗HCG mAb2，并继续向上泳动，最后到达膜上端的吸水纸。若尿样中含HCG激素，层析过程中，HCG便首先与金标mAb2结合。当其泳动到固定有HCG mAb1的检测带时，金标mAb2-HCG复合物便与mAb1反应形成夹心结构(mAb1-HCG-金标mAb2)并富集在检测带上，肉眼可观测到一条胶体金特有的红色线条，表明阳性结果。整个检测过程只需一次加样，2～15分钟可得检测结果。B、C、D 各方式的检测原理与此相似。

方式B以链亲合素固定于检测带，此方式有以下优点^［3］： （1） 固定于检测带的链亲合素可与各种生物素化抗体结合，具有通用性。（2）链亲合素的四价性，使其固定于膜材料后仍能保持较高的对生物素化抗体的反应活性。（3）链亲合素与生物素化抗体结合的高度稳定性。这些特点有利于提高免疫层析的检测敏感度和重现性。

方式C的标记物为金标二抗，其优点在于:（1）mAb2以可溶性干态吸附于层析条，从而保证了其对特定抗原完整的免疫反应亲和性和特异性。（2）层析过程中，mAb2与金标二抗可发生一定程度的聚集反应，从而使每个HCG分子可复合更多的金标记物。（3）免疫复合物中mAb2处于HCG与金标二抗之间，使体积很大的金标记物与HCG之间距离增加，从而减少了HCG与检测带多抗发生免疫反应的空间位阻。上述三因素都有利于检测灵敏度的改善。

方式D是一种比较早期的免疫层析技术，它在检测原理上与上述A、B、C三种方式相似，但在层析之前要求预先在小池中完成一步免疫反应，使用时稍嫌复杂。

二、免疫层析条制作关键技术

免疫分析固相技术是免疫层析条研制的关键，包括层析材料的选择、化学处理以及受体在层析膜上的固定等方面。可选择的层析材料有尼龙膜、PVDF膜、聚酯膜、纯纤维素膜、 玻璃纤维膜、硝化纤维素膜等多种类型，但硝化纤维素膜(NC膜)运用较多，这主要得益于NC膜的两个特性：高的蛋白吸附容量及其良好的亲水性所赋予的NC膜的快速层析特性。纯纤维素膜和羧化纤维素膜也是免疫层析的常用材料，但一般要求预先对其作化学处理，使其具有与受体蛋白(如抗体)共价连接的特性。常用的处理方法有苯醌法^［4］、溴化氰法^［5］和碳二亚胺法^［6］，分别如下式(1)、(2)和(3)：

无论采用物理吸附还是共价连接，对于固定于检测带的受体，要求具备如下几种性质:（1）受体与膜材料之间结合稳定性好；（2）足够的配体（如抗原或生物素化抗体)俘获容量；（3）简单的重现性好的受体固定工艺；（4）受体的固定不影响层析膜的毛细特性；（5）固相受体优良的贮存稳定性以及膜剩余吸附位点的有效封闭。而对于以干态吸附于流动带的标记或非标记抗体，其可流动性是评价其性能优劣的主要指标，往往要求在流动带加入高效助溶试剂，从而使吸附于流动带的抗体具有快速溶解的特性，使其在层析过程中具有接近于1的比移值。

层析材料的选择、处理以及受体固定是免疫层析条研制的关键技术，然而，与此相关的其他内容，如抗体的筛选和纯化、标记物制备、助溶试剂的选择等，也是免疫层析条研制的重要环节。

三、现状和展望

到目前为止，国外在国内销售的免疫层析产品已达20余种，可检测的待测物包括三个系列15个品种以上，包括人绒毛膜促性腺激素(HCG)、促黄体生成激素（LH）、促卵泡成熟激素（FSH）、A族乙型溶血性链球菌（Strep-A）、乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、胃幽门螺杆菌抗体（H.Pylori）、大便潜血（FOB）、甲胎蛋白（AFP）、前列腺特异抗原（PSA）、苯丙胺（Amphetamine）、可卡因（Cocaine）、大麻（Maruuana）、吗啡、海洛因等，某些物质的检测下限可达放免水平,如：心肌钙蛋白（cTnT）：0.4 ng/ml^［7］。同国外相比，目前国内这一领域的研究仍处于起步阶段，国内还没有国产材料制成的成型产品。而市售的20余种免疫层析产品均系进口国外散件国内组装或直接代销的国外产品。由于免疫层析产品市场巨大，在国内开展这一领域的研究，尽快研制出多品种、高质量的免疫层析产品，不仅可避免国内资金的大量外流，并且对提高我国国民健康水平，将起到不容忽视的作用。

除Acculevel层析法为定量检测外，其余大多数免疫层析分析均为定性检测。由于免疫层析分析要求得到可目测的实验结果，80年代初，这一检测方法主要受到检