急性间歇性卟啉症(acute intermittent porphyria, AIP)是常染色体显性遗传病。患者肝和红细胞中胆色素原脱氨酶(PBG-DA)缺乏，尿中大量胆色素原(PBG)和δ氨基γ酮戊酸(ALA)排出。目前该病主要以生化方法检查。笔者采用发根聚合酶链反应(PCR)结合内切酶分析检测AIP基因，行基因诊断，效果理想。

一、对象与方法

1.对象：检测一家族(附图)，其中8例(男3、女5)为AIP患者，8名(男5、女3)正常，均经临床和生化检测确定；3名已去世，去世者情况系经咨询确定。

附图一AIP患者家系图

2.试剂：生化试剂均购于华美公司。AIP外显子8引物(上海细胞所合成)：正义引物(5′-CAGTGAGTTGGCCAATCGAG-3′)，反义引物(5′-TGCATCTTCTGGGCACATCC-3′)。

3.仪器：PCR扩增仪(美国MJ公司PTC-200型)，电泳仪(GIBCOBRL v16-2型)，紫外分析仪(上海复星公司FS-312)。

4.DNA提取：取受检者头发每人3根(有发囊)，三蒸水洗涤2次，剪下发根约1 cm长，置0.5 ml Eppendorf管。每管加5μl 10×PCR buffer ［100 mmol/L Tris-HCl(pH8.3)，15 mmol/L MgCl₂，500 mmol/L KCl，1 g/L明胶］，5μl蛋白酶K(1 g/L)和26.5 μl三蒸水。60℃温浴30分钟，然后置100℃10分钟，12000 r/min离心5分钟。

5.PCR过程：(1)第1次PCR在含处理标本的离心管中加引物各2.5μl(20 μmol/L)、dNTP(1.25 mmol/L)各2 μl、Taq酶2.5 u，总体积50 μl。扩增条件：94℃5分钟后，94℃30秒、62℃30秒、72℃1分钟，循环30次。(2)第2次PCR另取0.5 ml Eppendorf管，与(1)相同组成的PCR反应体系49μl，加第1次PCR产物1μl。与前述相同条件再次扩增。

6.产物酶切：取12μl第2次PCR产物，置0.5 ml Eppe-ndorf管，加2 μl basJ Ⅰ内切酶，2 μl10×PCR buffer和4 μl三蒸水，60℃保温2小时。

7.电泳分析：取第1次、第2次PCR产物及第2次PCR后酶切物各8μl，与2μl溴酚蓝混合，点样在12%聚丙烯酰胺凝胶电泳。250 v电泳2小时。分子量标准为对照。电泳毕胶置0.5μg/ml EB液染色30分钟。紫外仪观察。

二、结果

8例患者第2次PCR产物的酶切物电泳，均出现213、132和81 bp三条阳性带。8名正常者只有213 bp一条阳性带。一次PCR产物电泳有弱阳性带，二次PCR产物电泳阳性带增强。

三、讨论

AIP基因位11q23.2-qter，至今已报道该基因的突变型有30多种，约一半是外显子10、12突变，其余有外显子1、4、5、6、8、9、14等的突变。主要突变方式是单个碱基替换，也有小片段插入和缺失。我们扩增AIP外显子8，产物为213 bp DNA片段，经BsaJ Ⅰ内切酶处理，有突变则产生132和81 bp片段，无突变者不被酶切。8例患者全部见三条阳性带，证实为突变杂合子；8名正常者，仅一条阳性带，证明无突变。结果符合率100%。本组未测到突变纯合子(只见132和81 bp)，符合该家系遗传规律。

卟啉病分七型，AIP是其中的一型。基因诊断能分型，且可明确突变位点。AIP基因突变热点多，引物选择不当会漏检。然而，一旦找到突变位点，与患者有血缘关系的其他成员就可用该引物检测。发根取材方便，远途可标本邮寄。本法较测序、单链构象多态性及其他基因检测手段简便^［1，2］，结果易观察，适合基层医院开展。一次PCR产物电泳后的条带弱，可能是发根DNA提取中有PCR抑制因子释放。本研究结果表明，二次PCR是必要和可行的。

参考文献

1Orita m, Suzuki Y, Sekiya T, et al. Rapid and sensitive detection of point mutations and DNA polymorphisms using the polymerase chain reaction. Genomics, 1989,5：874-879.

2Lundin g, Wedell A, Thunell S, et al. Two new mutations in the porphobilinogen deaminase gene and a screening method using PCR amplification of specific alleles. Hum Genet, 1994,93：59-62.

(收稿：1997-05-23修回：1997-10-23)