血清胆固醇(chol)测定是动脉粥样硬化性疾病防治、临床诊断和营养研究的重要指标。chol测定必须准确，实验室之间要有统一的标准，使结果接近“真值”。提高血清chol测定的准确性有赖于建立和推行标准化分析体系。chol测定标准化分析体系有方法和标准两个基本组分，方法按准确度高低分为决定性方法、参考方法和常规方法，决定性方法只用于发展和评价参考方法及鉴定纯chol，参考方法用于评价常规方法及为参考血清定值；参考标准也可分为三级，即chol纯度标准物质，血清标准参考物质和试剂盒中配备的商品校准物。纯度标准物质是chol测定的原始标准，它用于发展和评价参考方法及为血清标准物质定值，校准物的准确性应能溯源于血清标准物质。卫生部老年医学研究所生化室进行胆固醇测定标准化研究已10多年，始终坚持chol测定的准确性基础，从研制chol纯度标准物质着手，建立了高效液相色谱(HPLC)测定chol的参考方法，制备了可溯源于参考方法的血清胆固醇标准物质，初步建立起我国chol测定标准化的分析体系，现将我室研究成果及其前期工作基础作一简要回顾与综合。

化学方法的沿革

1.我国胆固醇测定方法研究始于50年代，当时临床上常用的Bloor氏法(1916)及醋酸抽提法，虽然比较简单但准确性不高。李健斋^［1］从研究经典的，准确性可溯源于称量法的Schenheimer-Sperry法(1934，1950)着手，采用其合理的chol抽提、皂化、分离纯化步骤，而以比较灵敏而稳定的FeCl₃反应(Zlatkis1953，Zak 1954)代替醋酐-硫酸反应(L-B反应，1890)，达到准确定量的目的。

2.50年代后期至70年代初有大量文献推荐chol直接测定法或简单的抽提后FeCl₃显色法^［2］，在国内风行十多年，但因chol既未提纯，FeCl₃反应特异性又差，所以结果有正偏差。70年代美国临床脂类研究(LRC)组织统一采用异丙醇抽提chol，沸石合剂吸附干扰显色反应的物质，然后以L-B反应测定，此法准确性较好，李培瑛等^［3］对此法作了评价，并以FeCl₃反应代替L-B反应，适于临床应用。

3.Abell等于1952年推出血清皂化后石油醚(后改用正己烷)抽提，L-B反应显色法，其准确性可溯源于Schenheimer-Sperry法。国内曾有少数实验室用作常规分析，其实在一般实验室条件下，不易准确掌握。美国疾病控制与预防中心(CDC)对此法作了评价与最适化研究^［4］，已成为国际公认的参考方法，称之为ALBK法，本室经多年实践，逐步掌握了此法，用CDC定值血清可测得符合CDC要求的chol浓度值。

对酶法的研究

国外从70年代开始出现酶法测定chol，由于具有简单、快速、特异性好、适用于自动化仪器等优点，酶法取代强酸试剂显色法成为必然趋势。推广应用酶法首先要有合格的胆固醇酯酶(CEH)和胆固醇氧化酶(COD)，最早出现的国产酶是上海医药工业研究院的“三合一酶”，其中CEH为动物胰脏提取，材料来源有限，制备过程麻烦，产量低，我们对“三合一酶”的性能进行了研究^［5］，虽能基本满足临床检验的要求，但CEH水解胆固醇酯(CE)的速度较慢；河北省微生物所在成功地研制了诺卡氏菌COD^［6］后，1984年筛选出一株产CEH的假单胞菌，从培养液中提取制备得一种高效、特异的CEH，我们对此酶的反应性能，特别是CEH对各种CE的水解效果作了鉴定，并与诺卡氏菌COD联用，设计了以Trinder反应为基础的总chol测定法^［7］，此项试剂配方已为一些生产厂家所采用，且已列入卫生部十年百项成果推广项目之一，中华医学会检验分会也将此法推荐为chol测定的常规方法^［8］。

目前国内实验室已普遍采用酶法，但对酶试剂质量的要求往往不够重视，为了有效地鉴定国内市场上血清chol试剂中CEH和COD的性能，我们设计了HPLC测定反应液中未被水解的CE和未被氧化的游离chol的方法^［9］，检查了十几种国产和进口试剂盒，发现多数试剂的CEH和COD性能良好，少数较差，我们主张酶试剂对CE的水解率和对chol的氧化率应达99%以上，要求反应在5分钟以内达到终点。

参考方法的建立

常规方法的准确性基础源于标准参考血清定值的准确性和用于定值的参考方法。CDC推荐的ALBK法对所用仪器精密度要求很高，操作必须按规定程序进行，ALBK法中CE皂化与正己烷抽提同步完成，粗看起来似乎简单，然而此法中四步液体转移的准确性、提取过程的完全程度、显色条件(时间和温度)的一致性等都直接影响分析结果，以我国目前的技术和设备条件用此法分析血清chol难以得到理想的结果；另外在L-B反应，FeCl₃显色法和酶法中，血清中的非chol甾醇都不同程度地参与显色反应^［10］，所以ALBK法测定结果比决定性方法高1.5%。我们通过研究国际上公认的决定性方法(同位素稀释-气相色谱-质谱法)的准确性基础，根据国内的条件，建立了HPLC-内标法测定血清chol的方法^{［11～13］}，血清(加内标)皂化后，将chol和内标提取到正己烷中并衍生成苯氨基甲酸酯，测定chol与内标的峰面积比，标准曲线法定量。同位素稀释-气相色谱-质谱法之所以被认为是最精密，最准确的分析手段是因为：(1)GC分离与质谱法检测为方法的特异性提供了双重保证。(2)同位素标记的chol作内标具有与chol相同的理化和色谱行为，内标与chol一旦准确混合，理论上就几乎不再存在影响精密度的因素。可见，利用简单的，以紫外吸收为检测手段的HPLC技术分析血清chol，要想消除非chol甾醇的影响，得到与决定性方法相符的结果，必须解决两个问题：一是内标与chol之间，内标及chol与血清中其他成分之间能完全分离；二是内标具有与chol相近的性质。chol与各种微量甾醇的结构非常相近，若提取后直接分离，则7-烯胆固醇与chol的分离十分困难，且由于检测波长低(210 nm)，无法得到较高的精密度；我们采用化学衍生的方法，将chol和其他甾醇衍生成具有较强紫外吸收的苯氨基甲酸酯，并以正己烷饱和的溶剂系统作流动相，不但得到了满意的分离效果，而且提高了紫外检测的精密度；理想的内标应具有与被测物相近的结构，理化性质和保留时间，商品甾醇类化合物多数存在于血中，不宜用作内标，为此我们合成了一系列甾体化合物，试用后发现6-氯豆甾醇与chol的理化性质和色谱行为十分接近，稳定性好，是本法中较为理想的内标。基于有效的色谱分离和合理的内标使用，本法显出良好的精密度与准确度，结果与决定性方法更接近，且易于掌握。已有三家实验室证明本法的可转移性。本法己被中华医学会检验分会推荐为血清chol测定的参考方法^［13］，用于血清chol标准物质的定值。

标准物质的研制

一、胆固醇纯度标准物质

chol纯度标准物质是血清chol测定的原始标准，chol测定标准化必须具备高纯度的chol标准物质，国际上应用最广泛的是美国NIST的SRM911b，纯度99.8%±0.1%，市售chol的纯度较低(95%～98%)，其主要杂质为chol代谢过程中的中间固醇，植物固醇和chol氧化产物，这些杂质与chol的结构相近，纯化困难。十多年来我们对chol纯化，纯化后chol纯度鉴定及均匀性和稳定性考察等做了仔细的研究，通过改进工艺，用溴化-脱溴法去除了市售chol中几乎所有的微量甾醇和chol氧化产物，用HPLC分离测定chol中微量甾醇的方法^［14］和差示扫描量热法进行纯度鉴定，给出chol纯度为99.8%，综合有关分析的偶然误差和系统误差给出不确定度为±0.1%^［15］，在鉴定过程中以SRM911b与本室纯化的chol平行对比，证明两者纯度相当；本品具有良好的均匀性和稳定性，由于chol在贮存过程中唯一可能发生的变化是自氧化，我们设计了HPLC测定微量chol氧化产物的方法^［16］，评价chol的稳定性，证明chol纯度标准物质在充氮、-20℃的条件下至少可以稳定两年。

二、血清chol标准物质

由于血清中大部分chol是以酯化状态存在的，且血清基质对酶的反应有明显影响，所以酶法测chol最好以定值血清作标准，而不宜用chol标准溶液。国际上chol参考血清主要有NIST的SRM909(由决定性方法定值)和CDC提供的参考血清(用ALBK法定值)。国内过去没有合格的chol参考血清供应，为国内各实验室间chol测定结果相差悬殊的原因之一。在制成chol纯度标准物质和建立chol测定参考方法的基础上，我们研制了chol参考血清^［17］，收集大批量新鲜健康人血清，混匀，过滤，加入适量防腐剂和稳定剂，无菌分装，作均一性与稳定性考察，用ALBK法和HPLC法定值。按所用制备工艺分装的血清均匀性良好，在-20℃至少可以稳定2年，经与NIST SRM 909血清及CDC参考血清核对，定值准确，已作为卫生部临床检验中心chol试剂盒鉴定用标准及国家八五、九五计划有关课题指定的chol标准。

胆固醇纯度标准物质和血清胆固醇标准物质均被国家技术监督局批准为国家一级标准物质(GBW09203a和GBW09138)。今后生产厂家制备的校准物应根据国家标准参考血清定值。

胆固醇测定现状调查

在我们的倡议下，京、津、沪三市临床检验中心在1991～1992年组织了三次血清chol测定情况调查^{［18～20］}，目的为推行chol测定标准化作准备，第一次调查显示实验室之间测定值的差异(室间CV)很大，合格率低；第二、三次用我们的参考血清作为统一标准，与第一次调查比较，成绩有显著提高，但三市各实验室的平均偏差及室间CV还大大超过美国chol教育