为探讨更特异、灵敏的检测血清或体液溶菌酶含量的方法，我们用自制溶菌酶抗体，建立检测溶菌酶含量的酶联免疫吸附试验(ELISA)，报告如下。

一、材料和方法

1.试剂：溶菌酶为Serva公司产品。辣根过氧化酶(HRP)购自华美公司，纯度值＞3，活性100 U/mg。所用包被液、洗涤液、稀释液、底物，按常法配制^［1］。

2.实验动物：健康雄性家兔，体重2 kg以上，未注射过抗原性异物，购自蚌埠医学院动物科。

3.免疫方法：1 mg/ml的溶菌酶完全佐剂抗原4 ml常规免疫家兔。1个月后用等体积的不完全佐剂抗原2 mg同法注射，以后每隔半月用不加佐剂的抗原注射1次，至抗体效价达到1∶32以上放血。整个免疫时间为3个月。

4.溶菌酶抗体的制备：按文献［1］，工作浓度1∶1 000。

5.酶标记溶菌酶抗体的制备：按文献［1］制备HRP-抗溶菌酶结合物，经方阵滴定其工作浓度为1∶100。

6.ELISA法检测溶菌酶含量：溶菌酶抗体1∶1 000包被，4℃过夜，洗3次，加稀释液稀释的2 000、1 000、500、250、125、62.5、31.25 μg/L标准品及样品，37℃1小时，洗3次，加1∶100稀释的HRP-抗溶菌酶，37℃1小时，洗3次，加底物显色10分钟，2 mol/L H₂SO₄终止反应，用DG-3022型酶联仪测490 nm 吸光度(A)值，根据标准品A值与样品A值计算拟合曲线，算出样品含量。各反应步骤每次加样量均为100μl。

二、结果

1.溶菌酶抗体的鉴定：将2 mg/ml的溶菌酶溶液与倍比稀释的抗血清作双向扩散测定，出现一条沉淀线。

2.灵敏度：最小检测限以零标准管重复测定10次，得其490 nmA值均数，以-2s查标准曲线，得出对应的溶菌酶浓度为6.5 μg/L。

3.回收率测定：一份已知溶菌酶浓度为5 mg/L样品，常规测定中分别加入1000、500、125 μg/L标准品，测得回收率分别为92%、97%、105%，平均回收率为98%。

4.重复性测定：一份已知溶菌酶浓度为5 mg/L的样品，经测定，批内CV为4.8%(n=18)，批间CV为7.8%(n=16)。

5.样本稀释度：为降低非特异性吸附，经试验，血清标本以1∶50倍、唾液标本以1∶100倍稀释时较为适宜。

6.标本存放时间对结果的影响：在无污染情况下，新鲜标本4℃存放1周，-20℃存放1个月对其检测结果无影响。

7.正常值：测定40例正常人血清、20例正常人唾液标本。结果正常人血清溶菌酶含量为8.5±3.4 mg/L，唾液溶菌酶含量为38.6±17.1 mg/L。

三、讨论

血清溶菌酶测定以往多采用琼脂平板法或比浊法测定，平板法不但敏感性低、稳定性差，还易受血清中IgG含量高低的干扰^［2，3］，免疫扩散法虽然敏感性与稳定性有所提高，但费时、繁琐，不能用于大量标本的检测^［3］。我们用溶菌酶作为抗原免疫家兔制备出高效价的抗血清并建立检测血清或其他体液溶菌酶含量的ELISA方法，实验结果显示，各项指标符合ELISA测定的质量要求，本法初步应用于对正常人血清、唾液的检测，其结果与有关文献一致^［2～4］。说明建立的ELISA法检测血清或其他体液溶菌酶含量是可行的。

参考文献

1 武建国，主编.实用临床免疫学检验.南京：江苏科学技术出版社，1989.70-103.

2 杨鸿藻，刘建国，杨军.溶菌酶两种测定方法的探讨.中华医学检验杂志，1994，17：186-186.

3 唐先平，孙桂兰.溶菌酶免疫测定法的实验研究.中华医学检验杂志，1994，17：157-157.

4 李影林，主编.临床医学检验手册.长春：吉林科技出版社，1987.1040-1042.

(收稿：1997-05-23 修回：1997-11-04)