关键词： 水疱性口膜炎病毒；光；亚甲基兰；病毒灭活

摘要目的：了解光化学灭活病毒时，VSV核酸的动态变化。方法：利用来源于VSV核衣壳蛋白基因的一对引物以RT-PCR法检测VSV的核酸。结果：RT-PCR最大检测灵敏度为1.8Lg TCID₅₀；在VSV光化学灭活过程中，RT-PCR产物量在5个灭活时间段上是不同的，随灭活时间的延长而减少。结论：光化学法对VSV核酸损伤程度随病毒灭活时间的延长而增大。

中图分类号Q503Q667Q522^＋4

Observation on Dynamic Change in Photo inactivation-Damaged Nucleic Acid of VSV by RT-PCR Method

Niu Hua,Sun Ping,Zhou Xipeng

(Institute of Transfusion,Beijing 100850)

【Abstract】Objective：To understand the dynamic change in nucleic acid of VSV(vesicular stomatitis virus)in inactivating the virus by photochemistry.Methods:The nucleic acid of VSV was detected using a pair of primers originated from the gene of VSV nucleic env protein.Results:The maximal sensitivity of RT-PCR method for VSV detection was 1.8Lg TCID₅₀.In the process of photochemical inactivation of VSV,the amount of RT-PCR product had varied at five time intervals of inactivation and decreased as the time of inactivation extended.Conclusion:The degree of VSV nucleic acid damage caused by photochemical method increases as the time of inactivation extend.

【Key words】RT-PCR;Vesicular stomatitis virus;Light／Methylene blue,Virus inactivation

利用光敏剂亚甲基兰(methylene blue,MB)和可见光处理血浆，可灭活血浆中的包膜病毒(如HIV^［1］)和一些非包膜病毒(如SV40)。MB／可见光协同作用产生单态氧(singlet oxygen,¹O₂）^［2］，¹O₂通过损伤蛋白和核酸的结构及功能而灭活病毒，可以作用于核酸链上的鸟嘌呤形成8-羟鸟嘌呤(8-oxoguanine)，引起脱嘌呤和核酸链的断裂^［3，4］；也可以在蛋白质之间，蛋白质和核酸之间形成共价交联^［5］。脱嘌呤、RNA链的断裂和交联将使RNA分子的逆转录、DNA分子的复制受阻。RT-PCR法是利用核酸分子的逆转录和复制来实现的，RNA链的变化将对RT-PCR的结果产生影响。根据RT-PCR产物量的变化可以观察光化学法对水泡性口膜炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)核酸的损伤程度。

1材料与方法

1.1病毒感染滴度的测定VSV(Indiana血清型)病毒原液(中国药品和生物制品检定所)用MEM培养液10倍稀释成10个稀释度，每个稀释度取0.1ml接种微孔板培养的Vero细胞，37℃，5%CO₂条件下培养72h，观察细胞病变。根据Muench方法^［6］，计算VSV感染滴度。

1.2RT-PCR扩增VSV核衣壳蛋白基因片段

1.2.1VSV RNA的提取参照Chomczynski^［7］方法进行：0.1ml病毒原液加入到1ml变性液中，室温放置5min，加入0.2ml氯仿，离心取上层液相，加等体积的异丙醇冷冻沉淀，70%乙醇洗涤1次，溶于12μl DEPC处理的水中，作为RT-PCR扩增的模板。

1.2.2RT-PCR扩增在20μl反应体系中进行逆转录，此反应体系包括：1×M-MuLV Buffer,200U M-MuLV,1mmol/L dNTPs,1.6μg随机引物和5μl VSVRNA；37℃逆转录1h。95℃ 5min灭活M-MuLV，取3μl作为PCR扩增的模板，利用1对来源于VSV核衣壳蛋白基因的引物P1(5’-ACGGCGTAC TTCCAGATGG-3’，位于VSV核衣壳蛋白基因编码区341～359碱基处)和P2(5’-CTCGGTTCAAGATCCAGGT-3’，位于VSV核衣壳蛋白基因编码区739～757碱基处)进行PCR反应，引物由军事医学科学院微生物和流行病研究所合成。50μl反应体系中包括：1×PCR Buffer,2U TaqDNA聚合酶，100μmol/L dNTPs，3μl 逆转录产物，P1和P2分别为0.4μmol/L。扩增条件：94℃变性60s，72℃延伸70s，55℃复性60s,35个循环。

1.3限制性核酸内切酶酶切鉴定扩增产物的特异性等体积氯仿抽提PCR扩增产物去除液体石蜡：在26μl PCR扩增产物中加入3 μl 10Buffer B,20 U Hinf I,37℃过夜消化。取15μl酶切产物电泳。

1.4RT-PCR方法检测血浆中VSV的敏感性VSV原液用牛血浆10倍稀释成10个稀释度，每个稀释度取0.1ml作为RT-PCR扩增样品。RNA的提取和目的片段的扩增参见方法1.2，以未加VSV的牛血清RNA提取物作为阴性对照。

1.5RT-PCR法检测VSV核酸在光灭活过程中的动态变化将15ml VSV原液加入85ml牛血浆中，混匀，再加入MB使其终浓度为0.3μg/ml，在45000Lux灯下分别照射0、15、30、60和120min，分别从5个灭活时间段取0.1ml的牛血浆作为RT-PCR扩增的样品。

2结果

2.1VSV感染滴度的测度0.1ml VSV原液经系列稀释后接种Vero细胞，72h培养后，测定其感染滴度为7.8Lg TCID₅₀。

2.2RT-PCR法扩增VSV核衣壳蛋白基因及扩增产物的特异性鉴定RT-PCR可以特异地扩增出VSV核衣壳蛋白基因片段，扩增产物的大小与预期的417bp一致(图1)。同时利用分子生物学软件推算出PCR扩增产物在328bp处有一限制性核酸内切酶HinfI酶切位点。HinfI酶切扩增产物可产生2个片段，大小分别为328和89bp。实验结果与预测的一致(图1)，扩增产物是特异的。

图1RT-PCR扩增VSV核衣壳蛋白基因及扩增产物电泳图

2.3RT-PCR法检测VSV的敏感性利用RT-PCR法可以检测出10^－6稀释度的牛血浆中的VSV，并且扩增产物量随稀释倍数的增加而递减。阴性对照未见有扩增带，扩增产物是特异的(图2)。

2.4RT-PCR法检测VSV核酸在光灭活过程中的动态变化利用RT-PCR法均可从光灭活处理的5个时间段扩增出特异性片段，但各灭活时间段扩增产物量有差异，扩增产物量随灭活时间的延长而递减(图3)。

图2RT-PCR检测牛血浆VSV的敏感性电泳图

图3RT-PCR法检测VSV核酸的动态变化电泳图

3讨论

MB／光化学法主要对包膜病毒起灭活作用，但其具体的作用机理还不清楚。核酸曾被认为是光化学法作用的优先目标^［8］，但其灭活效果可能因不同的病毒株而异。在PM2等噬菌体的光化学灭活实验中，DNA的损伤并不是灭活此病毒的主要作用^［9］；但在Qβ噬菌体灭活中，RNA和蛋白质的铰链则是主要作用^［5］。在本次实验中，VSV RNA的损伤是否为病毒灭活的主要作用，还有待于进一步确定。

RT-PCR可以检测出10^－6稀释度的牛血浆中VSV，相当于1.8Lg TCID₅₀，与国外报道的检测灵敏度^［10］在一个数量级上，但与细胞病变方法相比，低2个数量级。原因可能是由于单套RT-PCR检测灵敏度的限制，可以通过设计另一对引物进行套式RT-PCR，以提高检测的敏感性。

PCR产物的相对含量可以通过在同一电泳体系中，各目标片段中掺入溴化乙锭发出荧光强度来确定^［11］，如在竞争性RT-PCR中广泛作用的定量方法^［12］。在本实验中，根据扩增片段发出的荧光强度的强弱，定性地确定5个处理时间段上扩增产物相对含量。RT-PCR均能从5个处理时间段上扩增出目标片段，提示：MB／光化学法不能彻底地断裂VSV核酸链或将核酸链与蛋白彻底交联，但5个时间段扩增产物的相对量是不同的，说明光化学法对VSV RNA具有损伤作用，并且这种损伤效应随着灭活时间的延长而加大，这种对核酸的损伤效应也在HIV的光灭活实验中观察到^［13］。扩增产物大小为417个碱基对，而VSV整个基因组全长为11161碱基，整个基因组受损伤的几率是长度为417个核苷酸片段受损伤几率的25次方，实际损伤程度比实验结果大。本实验所采用的方法是传统RT-PCR，只能定性地确定VSV核酸受损伤的程度，定量地衡量病毒核酸受损情况必须借助竞争性RT-PCR等定量方法来反映。

参考文献

1，Lambrecht B,Norley SG,Kurth R,et al.Rapid inactivation of HIV-I in single donor preparations of human fresh frozen plasma by methylene blue/light treatment.Biologicals，1994；(22)∶227

2，Epe B,Pflaum M,Boiteux S.DNA damage induced by photosensitizers in cellular and cell-free systems.Mutat Res,1993,299∶135

3，Floyd RA,We