南通医学院附属医院王惠民

关键词：核酸杂交-酶呈色技术；PCR

摘要：在 pCR检测中常可出现一些非特异扩增，尤其在模板不纯或反应条件不适时。溴乙锭-琼脂糖电泳检测 pCR产物，虽有快速简便等优点，但其分辨力较差，很难区分非特异区带，聚丙烯酰胺凝胶电泳操作繁杂，亦不能区分分子量相近的扩增产物。为能特异鉴定 pCR产物，可利用套式 pCR或限制性内切酶分析法，但前者易造成污染，后者受制于必须有合适价廉的内切酶。最近，有作者用时间分辨免疫荧光法配合核酸杂交检测 pCR产物，具有较好的敏感度与特异性〔1、2〕，用质谱法检测 pCR产物，并可观察到点突变〔3、4〕，用毛细管电泳可准确测定 pCR产物分子量，并可进行定量〔5〕，但这些均需昂贵的设备。

利用特异性探针与扩增产物杂交，引用 eIA中酶呈色技术，既解决了 pCR产物的特异性检测，又由于酶系统的放大作用提高了检测敏感度，该技术在国内外已成功地用于常规 pCR项目的检测。该法与放射性同位素标记法相比，具有相近的敏感度与特异性，并具试剂来源方便、稳定、无同位素污染等优点。很多文献将这一类方法统称为 pCR－ eLISA方法 ， 因为某些方法使用的为生物素－亲和素－酶偶联系统，因此这样的归类似不妥 。

1、常用核酸杂交方法

1.1.点杂交（或 southern杂交）

将 pCR产物固相于膜上，再用标记探针杂交为正向杂交，正向杂交常用来以不同的标记探针鉴别不同基因突变位点或病原微生物亚型，该法操作繁杂，测定时间较长。如将寡核苷酸探针固相于膜上，标记的 pCR产物与固相化探针杂交称为反向杂交，方法相对简便，多用于常规项目测定〔６〕。

用于固相化的膜主要为硝纤膜与尼龙膜〔７〕。硝纤膜与核酸非共价结合，在80℃烘烤2小时后结合牢固，与蛋白质非特异性结合较弱，因此本底较浅。但对结合条件要求较严格（如必须在高盐浓度），小片段核酸（＜200bp）结合不理想，膜脆性大，操作中易破损。而尼龙膜与核酸共价结合，小至10bp亦牢固结合，对反应要求不高，不需烘烤，具较好弹性且不易损坏，可多次重复使用，与核酸的结合能力（300-500ug/cm2）显著高于硝纤膜（80-100ug/cm2）,但与蛋白质有较高亲和力，本底较深。

1．2.微孔板杂交

正向杂交： bortolin等〔8〕检测 bCR-ABL基因时，引物5'端标有生物素，扩增产物固相化于包被有链霉亲和素的聚苯乙烯板上，以3'端标记地高辛的探针与之杂交，该法的敏感性高于 southern等方法。

taniguchi等〔9〕用氨基化引物扩增靶 dNA后，将 pCR产物与商品化羧基微孔板以肽链交联固相化，用地高辛标记探针杂交。该法的固相化过程约需四小时，测定时间较长。

Chang等〔10〕简化了此类杂交法，以生物素-亲和素方式将 pCR产物固相于微孔板上，由于在扩增过程中在产物上掺入 dig-11-dUTP，产物含有大量地高辛（ dig），由于多个 dig的放大作用，测定敏感度可达100%。我们亦以生物素－亲和素方式将 pCR产物固相于微孔板 上，以荧光素标记探针，抗荧光素抗体－酶进行呈色，成功地测定了 hCV、 hGV RNA与端粒酶活性质[11－13 ]。美国 digene Diagnostics公司发展了一种称之为 sHARP放大信号的方法，即利用生物素－亲和素系统固相 pCR产物 ，设计互补的 RNA与之杂交 ，酶标抗 dNA： rNA单克隆抗体与之类结合并呈色[14]。

反向杂交：首先将探针固相于微孔板上，固相化的方法很多，通常可将微孔板包被有蛋白质（如亲和素或链霉亲和素、抗 dig-抗体、牛血清白蛋白）或已知序列的核苷酸，此为通用型活化微孔板，任何探针末端只要含有相应配体或与已知序列互补的核苷酸都可与相应的活化微化板固相化。我们设计了 hBV特异探针，其-端含-段与通用板已知序列互补的核苷酸，引物5'端修饰有生物素， hBV DNA PCR产物与固相化探针杂交后，即可用酶标亲和素进行酶呈色测定，并证实其测定敏感度至少高于普通电泳法100倍〔15〕。

sandwich杂交：或称夹心杂交法，即在反向杂交的基础上，在 pCR产物的另一区域设计探针，该探针末端标记有生物素、 dig或荧光素等。通常将固相化于微孔板的探针称为捕获探针，与酶呈色相连接的探针称为检测探针。 keller等〔16〕用该法检测 hBV-DNA，与放射性标记的 southern方法比较具相同的敏感度与特异性，检测限度达5个拷贝。 cros等〔17〕将捕获探针标记 bSA，与包被有抗 bSA的微孔板固相化，检测探针标记辣根过氧化物酶，用于 hLA的分型，较原先的点杂交更为准确与快速，在4小时内完成 hLA的基因分型。 sandwich杂交的特点是：（1）由于两个杂交过程检测一个产物，特异性较一次杂交强〔18-20〕；（2） pCR引物无需进行标记。

微孔板杂交与点杂交或 southern法比较，由于省却了膜的点样、烘烤及简化了漂洗等步骤，使杂交方法更为方便与省时，尤其是反相杂交由于可预先进行探针固相化，一般在二小时内可完成产物检测，易于临床推广应用。但反向杂交其探针的固相化技术极为复杂，一般实验室很难完成。正向杂交方便、快速、重复性较好，一般以生物素－亲和素系统固相 pCR产物，地高辛－抗地高辛－酶或荧光素－抗荧光素－酶进行呈色。微孔板杂交法的酶反应在液相中进行，可以比色，适当改良可用于半定量或定量测定。

1.3.磁珠杂交Heermarn等〔21〕将包被有链霉亲和素的聚苯乙烯磁珠（挪威 dynal公司）与生物素化引物结合后捕获靶核酸（ dNA或 rNA），扩增 （或逆转录扩增），用相应探针杂交、酶呈色。由于固相引物的磁珠捕获靶核酸后，可较易与样品混合物分离，所以该法极大地简化了靶核酸的抽提，离心管中磁珠可牢固吸附于磁板上，利用相应设备可使样品预处理、杂交、呈色实行全自动化。 roche公司将探针用化学法固相于磁珠上，与含生物素的 pCR产物杂交，设计了全自动化 pCR检测仪 cOBAS AMPLICOR，用于检测衣原体、淋球菌、抗酸杆菌及 hCV等有较好的效果〔22〕。

2、 常用的标记及呈色法常用标记、呈色方法主要有生物素-亲和素系统、 dig-抗 dig系统，荧光素-抗荧光素系统，后两种系统由于引入了抗原-抗体反应，所以又称为 eIA呈色系统。通常蛋白质部分标记酶或包被微孔板，非蛋白质部分标记核酸。

常用的荧光素为 fITC，修饰引物的5'端，其扩增产物与 hRP标记的抗 fITC抗体作用，然后进行酶呈色。

常将生物素标记于引物的5'端，使其扩增产物固相于含亲和素的微孔板或与酶标亲和素结合而呈色，亦有作者〔23〕在扩增产物中掺入 biotin-11-dUTP，使测定具更高的敏感度。

亲和素是 pI较高的糖蛋白，对聚苯乙烯板与硝纤膜有较高的非特异性吸附。而链霉亲和素 pI为6.0，非特异结合远比亲和素低，几无本底。生物素-亲和素系统亲和力高、价廉、方法稳定。

Dig标记系统自八十年末产生以来，由于敏感度高而受到人们的重视。 dig可标记于探针或引物，常用的有3'端标记法、5'端标记法及3'端加尾法，前二法末端标记一个 dig，3'端加尾可连接多个 dig而提高检测敏感度。亦可在 pCR反应液中加 dig-11-dUTP，使 pCR产物链上含多个 dig，但应注意到此法扩增效率较普通 pCR差，如反应液中 dig-11-dUTP浓度过高，可因产物高密度 dig空间位阻而影响杂交〔24〕。

Dig为半抗原结构，抗体效价不高，过量或长时间使用阻断剂或漂洗，均会使信号减弱。 dig标记条件要求高，虽已有商品化标记试剂盒，但操作仍须十分小心，并具一定经验。现已有公司提供含地高辛的引物，其与荧光素标记的引物的优劣有待进一步探讨。同一测定中如需二种系统标记，往往第一次反应用生物素-亲和素系统，后继反应用 dig-抗 dig系统〔24-25〕或荧光素抗荧光素系统[11－13]。

3． 核苷酸的固相化技术硝纤膜或尼龙膜可非特异结合核酸，无需特殊的固相化方法。

微孔板或磁珠可包被蛋白质（如抗荧光素 igG、抗 dig IgG、亲和素）与标记有相应配体的核苷酸结合稳定。还可借其它的一些化学键固相化，具体方法可参考有关文献〔8、16、25〕。

4． 应用举例 ： PCR微孔板杂交酶呈色检测 TTV DNA〔13〕

4． 1引 物 T2 5'biotin CAT GTA TAG GAT AGA CTG T3 5'biotin CCT GGC AAT TTA CCA TTCC探针 5'FITC－ CTA CCT CTA TGG GCA GCA GCA

4．2核酸提取 100ul血清加200 ul裂解液〔11〕混匀，置室温10min，加300 ul异丙醇，于4℃12000rpm离心15 min弃上清，70％预冷乙醇洗涤沉淀真空抽干，加10 ul DEPC H2O或 TE（ pH 8.0）溶解备用 。

4．3 PCR取模板5 ul加 20 ul反应液（ 含 T2/T3引物，其余成分见文献15），94℃预变性3 min，94℃45 S，56℃45 S，72℃60S，循环35次，最后72℃延伸5min， pCR产物作微孔板杂交 。

4. 4包被微孔板 每孔加含1ug streptavidin的碳酸盐缓冲液（ PH9.2）100 ul，4 ℃过夜，轻轻弃去液体，加300ul封闭液（ pH7.4 PBS，3％ bSA，0.05％ tween-20）,42℃孵育2小时，弃去液体，真空抽干，置－20℃备用，至少可用1月。

4. 5扩增产物检测 将扩增产物与变性液（ 0.3mol/L NaOH）等量混匀 ，室温变性5 min，取25 ul加入微孔板，再加入100 ul杂交