军事医学科学院院刊2000年第24卷第2期

应万涛钱小红

摘要生物质谱因其高灵敏度、高准确度、快速、易于自动化等特点，在生命科学领域的应用和研究日益广泛。该文综述了近年来生物质谱在蛋白质、核酸、糖类、药物代谢以及微生物检验等方面的应用及进展。

关键词：生物质谱；电喷雾；基质辅助激光解吸附；串联质谱

1概述

生命科学的发展总是与分析技术的进步相关联，X射线晶体衍射对DNA双螺旋结构的阐述奠定了现代分子生物学的基础，使人类对微观领域的认识迈出了决定性的一步。原位PCR技术的出现使得生命科学在微观领域的研究不再是可望而不可及。大规模、自动化基因测序技术的问世，使本世纪生命科学领域最宏大的研究项目——人类基因组计划的实施比预期一再提前。而后基因组时代，即功能基因组和蛋白质组计划的实施所必需的高通量、大规模筛选对分析方法又一次提出了挑战。已发展了一百多年的质谱技术，由于其所具有的高灵敏度、高准确度、易于自动化等特点，毫无疑问地成为解决上述问题的关键手段之一。

自1886年Goldstein发明早期质谱仪器常用的离子源，到1942年第一台单聚焦质谱仪商品化，质谱基本上处于理论发展阶段。随后质谱在电离技术和分析技术上的发展和完善，使之很快应用于地质、空间研究、环境化学、有机化学、制药等多个领域。然而，即使在等离子体解吸（plasma desorption,PD)和快原子轰击（fast atom bombardment,FAB)两项软电离质谱技术出现以后，质谱分析的相对分子质量也只是在几千左右。真正意义上的变革以80年代中期出现的两种新的电离技术：电喷雾电离（electrospray ionization,ESI）^［1］和基质辅助激光解吸电离（matrix-assisted laser desorption ionization,MALDI）^［2］为代表，这两种技术所具有的高灵敏度和高质量检测范围，使得在fmol（10^-15）乃至amole（10^-18）水平检测相对分子质量高达几十万的生物大分子成为可能，从而开拓了质谱学一个崭新的领域——生物质谱，促使质谱技术在生命科学领域获得广泛应用和发展。

2生物质谱仪

目前商业化的生物质谱仪，其离子化方式主要是电喷雾电离与基质辅助激光解吸电离，前者常采用四极杆质量分析器，所构成的仪器称为电喷雾（四极杆）质谱仪（ESI-MS），后者常用飞行时间作为质量分析器，所构成的仪器称为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）。ESI-MS的特点之一是可以和液相色谱、毛细管电泳等现代化的分离手段联用，从而大大扩展了其在生命科学领域的应用范围，包括药物代谢、临床和法医学的应用等；MALDI-TOF-MS的特点是对盐和添加物的耐受能力高，且测样速度快，操作简单。此外，可用于生物大分子测定的质谱仪还有离子阱（ion trap,IT）质谱和傅里叶变换离子回旋共振（Fourier transform ion cyclotron resonance,FTICR）质谱等。而最近面市的最新型的生物质谱仪是液相色谱-电喷雾-四极杆飞行时间串联质谱仪（LC-ESI-MS-MS）与带有串联质谱功能的MALDI-TOF质谱仪，前者是在传统的电喷雾质谱仪的基础上采用飞行时间质量分析器代替四极杆质量分析器，大大提高了仪器的分辨率、灵敏度和质量范围，其商品名有Q-TOF^［4］和Q-STAR^［3］等；后者是在质谱中加入了源后降解（post-source decay,PSD）模式或碰撞诱导解离（collisionally induced dissociation,CID）模式，从而使生物大分子的测序成为可能。

3生物质谱的应用

3.1蛋白质和多肽的分析

3.1.1分子量测定分子量是蛋白质、多肽最基本的物理参数之一，是蛋白质、多肽识别与鉴定中首先需要测定的参数，也是基因工程产品报批的重要数据之一。分子量正确与否往往代表着所测定的蛋白质结构正确与否或者意味着一个新蛋白质的发现。生物质谱可测定生物大分子分子量高达40万，准确度高达0.1%～0.001%，远远高于目前常规应用的SDS电泳与高效凝胶色谱技术。

3.1.2肽谱测定肽谱是基因工程重组蛋白结构确认的重要指标，也是蛋白质组研究中大规模蛋白质识别和新蛋白质发现的重要手段。通过与特异性蛋白酶解相结合，生物质谱可测定肽质量指纹谱(peptide mass fingerprint,PMF)，并给出全部肽段的准确分子量，结合蛋白质数据库检索，可实现对蛋白质的快速鉴别和高通量筛选。PMF常和胶上原位酶解相结合，成为蛋白质组研究中必不可少的一种手段^［5,6］。此外根据肽段质量数变化，可对基因产品的插入、缺失、突变进行对比分析。

3.1.3肽序列测定技术构成蛋白质的常见氨基酸有20种，一段3个氨基酸的肽段碎片将有8000种可能的排列方式，4个氨基酸将有160 000种排列方式，即一个特定的4个氨基酸序列的出现概率为1/160000。因此，即使对于一个相当大的蛋白质组来说，五、六个氨基酸残基的序列片段已具有很高的特异性。串联质谱技术可直接测定肽段的氨基酸序列，从一级质谱产生的肽段中选择母离子，进入二级质谱，经惰性气体碰撞后肽段沿肽链断裂，由所得到的各肽段质量数差值推定肽段序列，用于数据库查寻，称之为肽序列标签技术（peptide sequence tag,PST）^［7,8］，目前广泛应用于蛋白质组研究中的大规模筛选。较之传统的Edman降解末端测序技术，生物质谱具有不受末端封闭的限制、灵敏度高、速度快的特点。另外，一种间接的肽序列测定技术即肽阶梯序列技术（peptide ladder sequence）^［9，10］，通过末端酶解或化学降解，产生一组相互之间差一个氨基酸残基的多肽系列，经MALDI-TOF-MS鉴定后，由所得到的肽阶梯图中各肽段的分子量差值确定末端的氨基酸序列，从而用于数据库查寻。

3.1.4巯基和二硫键定位二硫键在维持蛋白和多肽三级结构和正确折叠中具有重要作用，同时也是研究翻译后修饰所经常面临的问题，自由巯基在研究亚基之间及蛋白与其他物质相互作用中具有重要意义。利用碘乙酰胺、4-乙烯吡啶、2-巯基苏糖醇等试剂对蛋白质进行烷基化和还原烷基化，结合蛋白酶切、肽谱技术，利用生物质谱的准确分子量测定，可实现对二硫键和自由巯基的快速定位与确定^［11］。这在含有多二硫键结构的活性多肽与蛋白质研究中有重要用途。

3.1.5蛋白质翻译后修饰蛋白质在翻译中或翻译后由于不同功能所需会发生二十多类修饰，其中最常见的是磷酸化和糖基化，这些修饰将影响蛋白质的电荷数、疏水性、构象和稳定性，进而影响其生物活性，因此，在基因工程重组蛋白评估时，翻译后修饰也被认为是影响活性的一个重要因素。传统的Edman降解技术会破坏蛋白质修饰，肼解方法虽能得到糖链并鉴定之，但却不能进行糖链的准确定位。结合肽谱和脱磷酸酶作用，目前已可以用MALDI-TOF-MS对双向电泳分离蛋白质磷酸化位点进行定位^［12］。凝集素可对糖链进行特异性吸附，利用这一性质，可用凝集素对糖蛋白酶解后的肽混合物进行选择性吸附，MALDI-TOF-MS测定质量数，再用糖苷酶降解含糖肽，质谱测定后即可确定糖链的大小，结合不同的酶解方式可确定糖基化位点^［13］,选择不同的凝集素,还可确定糖链的连接方式。串联质谱技术中子离子扫描模式可以快速选择被修饰片段，然后可根据特征丢失确定修饰类型^［14］，是目前最有效的对蛋白质翻译后修饰进行识别与鉴定的分析手段。这方面的研究已有大量文献报道。鉴于修饰的多样性，目前已有人结合生物质谱技术，通过分析数千例蛋白质翻译后修饰，建立蛋白质修饰数据库FindMod^［15］，其完善和发展必将推动蛋白质大规模鉴定的进程。

3.1.6生物分子相互作用及非共价复合物蛋白质与其他生物分子相互作用在信号传导、免疫反应等生命过程中起重要作用。软电离技术的发展，促进了生物质谱在蛋白质复合物研究中的应用，目前已涉及了分子伴侣对蛋白折叠作用、蛋白/DNA复合物、RNA/多肽复合物、蛋白质-过渡金属复合物及蛋白-SDS加合物等多种类型的复合物的结构及结合位点的研究^{［16～20］}。

3.2多糖结构测定

多糖的免疫功能是近年来研究的热点领域，其结构的测定是功能研究的基础。多糖不像蛋白质和核酸，其少数的分子即可由于连接位点的不同，而形成复杂多变的结构，因而难以用传统的化学方法研究。生物质谱具备了测定多糖结构的功能，配以适当的化学标记或酶降解，可对多糖结构进行研究^［21］。采用MALDI-TOF-MS已对糖蛋白中的寡糖侧链进行了分析，包括糖基化位点、糖苷键类型、糖基连接方式以及寡糖序列测定^［22］等。与传统的化学方法相比，质谱技术具有操作简便、省时、结果直观等特点。

3.3寡核苷酸和核酸的分析

目前，生物质谱已经实现对数十个碱基寡核苷酸的分子量和序列测定^［23］，此技术可用于天然或人工合成寡核苷酸的质量控制。人类基因组有30亿个碱基，但真正与疾病有关的目前仅知道只是少数可变的基因。基因库中有一个很丰富的资源即300万个单核苷酸多态性片段（SNP），它是一类基于单碱基变异引起的DNA多态性，由于其位点丰富（每一千个碱基约一个多态性），使得在鉴定和表征与生物学功能和人类疾病相关的基因时，它可作为关联分析的基因标志。SNP不一定要准确定位，关键是测定其在种群<