中华检验医学杂志2000年第23卷第4期

赵武述

关键词：细胞因子；检测方法

细胞因子的检测方法可分为分子生物学测定法，生物活性测定法和免疫化学测定法三大类。现拟就其检测技术的进展和现状作一简要介绍。

一、分子生物学测定法

这种方法是测定细胞因子mRNA的表达水平。由于细胞因子mRNA半衰期短和拷贝数少，采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法，因其灵敏性高和操作简便，比Northern印迹法和原位杂交法更有临床应用前景^［1］。

RT-PCR法的扩增技术日臻成熟，目前的主要问题是如何防止假阳性和如何方便定量。假阳性困扰所有PCR操作，这个问题的克服有赖于对操作环境和操作规程的规范及严格限制，有赖于简化及合并操作流程，提倡单管中密闭操作，测定荧光强度代替电泳图像定量法。PCR的定量首先要解决标准化的对照模板，对照模板在逆转录和扩增上与细胞因子的天然模板相同，但扩增产物有所差异，定量时容易鉴别区分。国外一些实验室和公司已制备出若干细胞因子的竞争性mRNA模板，这种模板两端具有与欲测细胞因子引物互补的序列，而模板的中间部分比该细胞因子正常mRNA略短或略长。随着PCR技术的发展和完善，随着细胞因子引物和对照模板的标准化，细胞因子的分子生物学测定方法将会用于临床。

二、生物活性测定法

特异的生物活性和免疫化学特性，是鉴别细胞因子的重要指标；并且，独特的生物活性往往是细胞因子被发现的先导。当然，鉴于细胞因子活性有普遍的重叠性，以生物活性命名造成混乱，现在生物活性在细胞因子的认定上，已降为次要指标，一种新细胞因子的鉴定主要依据其有独特基因结构。尽管如此，由于生物活性测定法提供的是生物功能信息，故本法依然是一种基本的和必需的测定法。

本法是基于测定细胞因子的生物活性，诸如其刺激细胞增殖活性、其维持细胞生长和存活活性、其抑制细胞生长活性、其溶解或杀灭细胞活性、其抗病毒活性、其促进细胞趋化活性、其刺激细胞生成集落活性等等^［2,3］。生物活性的指示细胞多选用造血系统或淋巴系统细胞，显示细胞反应最多的是，用³H-胸腺嘧啶核苷参入，或用四唑盐转化引致的颜色反应。指示细胞可为原代细胞，最好用细胞株，尤其依赖性细胞株细胞。原代细胞不均一，尤其当用人的原代细胞时难免个体差异，数人混合可减少这种影响。细胞因子依赖细胞株细胞的生长和增殖敏感性主要依赖于某一种细胞因子，而对其他细胞因子不反应或反应性极低。细胞因子依赖细胞株的选择和使用可参照文献^［4，5］进行。依赖性细胞株细胞不仅均一，而且在特异性灵敏性方面也明显优于原代细胞和非依赖株细胞。但依赖株细胞的特异性并非绝对，特异性差就成为生物活性测定法普遍的缺点。

细胞因子的受体亲和性高，细胞因子浓度10^-10～10^-15 mol/L时就可显示生物作用，所以其测定的灵敏度高，一般在免疫化学测定法之上。测定范围在10～100倍，信号与噪音比≥5。生物活性测定法测定的是有生物活性的细胞因子，前体分子、降解片断、与结合蛋白或可溶性受体结合的细胞因子、细胞因子聚合物均不能用此法测定；细胞因子受体拮抗物、细胞因子的天然抗体和一些病毒编码的类细胞因子^［6］，也能干扰测定。检验样品中是否有干扰，可将被测样品稀释，作样品剂量-反应曲线，看其是否与细胞因子标准品的剂量-反应曲线平行。

生物活性测定法的缺点是，除需维持靶细胞株，操作繁杂和难定量外，特异性差是最主要缺点。除依赖细胞株的原因外，由于细胞因子受体有共有链，也引起细胞因子活性有交叉性，如白细胞介素（IL）-1和肿瘤坏死因子（TNF）-α；IL-4与IL-5和IL-7，IL-3与粒细胞单核细胞-集落刺激因子（GM-CSF）等。降低这种干扰的方法是，在测定样品中加入抗干扰性细胞因子的中和抗体，中和起干扰的细胞因子活性。

三、免疫化学测定法［7，8］

本法利用抗体对抗原表位的识别，测定的是可溶性细胞因子的抗原性。

生物素、亲和素放大系统引入酶标测定系统后，大大提高了酶联免疫吸附测定（ELISA）法的灵敏度。若灵敏度选在高于本底信号2～3个标准差，目前多数细胞因子的ELISA试剂盒可测至5～10 ng/L，已接近生理浓度，也达到放免法的灵敏水平，因此，目前国外公司推出的细胞因子检测试剂盒，绝大多数都是采用ELISA法。

夹心ELISA法要有抗同一细胞因子不同表位的两个抗体。一个抗体用于包被作捕捉抗体用；另一个抗体分子作检测用，其分子上标记生物素。生物素分子与标记酶的亲和素分子结合。一般用单抗作包被抗体，用多抗或几个单抗混合起来作检测抗体，这样可以提高检测的灵敏度。ELISA法的优点是特异、方便、易标准化和批量化，很适合临床应用。其缺点为提供的是免疫活性信息而不是细胞因子生物活性信息。细胞因子前体分子、细胞因子分解片断、细胞因子聚合物、细胞因子与结合蛋白或可溶性受体结合物、虽均无生物活性，但依然可为免疫化学法测定。除此之外，血清或体液中的嗜异性抗体^［9］、抗类风湿因子等自身抗体也能干扰测定结果。

用ELISA检测细胞因子时，首先要弄清所测细胞因子的性质和其存在形式与部位，正确解决标本选择、标本收集时间、污染防止和减少干扰等问题，才能获得满意结果。体内多数细胞因子在生理情况下，血中浓度极低，不宜用血标本测定。但一些经常性分泌的细胞因子，如红细胞生成素（EPO），粒细胞集落刺激因子（G-CSF）等，或某种病理情况下能引起其分泌亢进的细胞因子，可用血浆或血清直接检测。在某些病理情况下，一些细胞因子参与局部病变，这类细胞因子往往在局部体液中浓度升高，这种体液也可选为检测标本。细胞培养上清液是测定体外刺激培养细胞的细胞因子常用的标本。但收集上清液的时间，应考虑细胞因子分泌的动力学。任何给定时点的细胞因子浓度，都是分泌和消耗及分解的总和，都是这一时点的瞬时结果。不同的细胞因子的分泌峰时不同。此外，产生细胞、活化剂种类、培养条件等不仅会影响分泌细胞因子的种类和分泌量，而且会影响峰值出现的迟早，为了获得稳定的结果，应严格控制。各种标本中一旦有细菌和其他微生物污染，在操作过程中就会引入新的干扰。当血液样品中受污染，内毒素含量达到10μg/L时，在37℃下放6小时就会显著分泌IL-1、TNFα、IL-6和IL-8，而这种污染程度肉眼尚难观察。有实验表明，肝素抗凝样品易受污染影响，其次是枸橼酸抗凝，而乙二胺四乙酸抗凝受污染影响最轻。此外，取样品后立即转入4℃保存也是降低污染影响的有效措施。

四、细胞内细胞因子测定法［10-12］

本法测定的是细胞因子的前体分子；测定的是单一细胞行为。如前所述，除测经常表达和病理情况下亢进表达的细胞因子，可直接取样品细胞测定外，一般要用适当活化条件先活化细胞，使之合成欲测细胞因子。由于活化过程中加入蛋白质运输抑制物，如莫能菌素(monensin)和布雷菲尔德菌素A，阻止了细胞因子分泌，提高了阳性率。

荧光染色可用荧光显微镜检查，最好用流式细胞仪测定^［13,14］。其操作的大体步骤是：分离制备细胞、活化细胞、封闭细胞表面Fc受体、细胞表面抗原染色、固定和通透、细胞内细胞因子染色、流式细胞仪测定和结果分析。若用外周血测定，活化起始细胞一般用单个核细胞。活化T细胞除用抗原外，主要植物血凝素(PHA)、巴豆酯(PMA)、离子霉素（ionomycin）、钙离子载体A23187、T细胞受体抗体或CD3的抗体等；活化B细胞除抗原外，多用脂多糖（LPS）、金黄色葡萄球菌肠内毒素A及B细胞受体抗体；活化单核细胞用LPS和某些细胞因子。由于抗原活化效率低，多用多价活化剂和几种合用活化细胞，要根据测定目的选择。酶联免疫斑点法（enzyme-linked immunospot assay, ELISPOT）测细胞因子，在细胞分离制备、活化、固定和通透步骤与流式细胞仪法完全相同。 eLISPOT法引入生物素、亲和素放大系统后，灵敏度大为提高，在测定细胞因子产生阳性细胞频度方面，与流式细胞仪法平行^［15］。但后者可同时分析产生细胞性质和其他因子的产生情况，且结果更为客观。

细胞因子检测的主要临床应用有：（1）机体免疫状态的评估；（2）疾病预后及治疗监测指标；（3）病理变化和损伤机理研究；（4）辅助诊断^［16］。细胞内细胞因子检测辅助性T细胞亚群，在临床上有重要应用价值^［17］。不同检测方法各有优点，各有局限，配合应用才能排除干扰，获得正确结论。

作者单位：赵武述(100029北京，中日友好医院临床医学研究所)

参考文献

1，Dallman MJ, Montgomery RA,Larsen CP, et al. Cytokine gene expression: analysis using Northern blotting, polymerase chain reaction and in situ hybrodization. Immun Rev, 1991,119:105-110.

2，Burke F, Rozengurt E, Balkwill FR. Measurement of proliferative, cytoltic and cytostatic activity of cytokines. In: Cytokines: a practical approach. balkwill FR (ed ). New York: LRL Press, 1995.279-296.

3，Wadhwa M, Bird C, Page L, e