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熊礼宽杨应周庄玉辉
关键词：龟分枝杆菌；诊断
近年来，医源性速生长分枝杆菌(Rapidly growing mycobacteria,RGM)感染暴发流行的报道日益增多，如手术伤口、器官移植、透析和注射后皮下感染等［1-4］。特别是龟分枝杆菌、偶发分枝杆菌等感染。龟分枝杆菌最初由Friedman于1903年从柏林动物园中的龟甲中分离出来，由于其生长速度快，故属于RGM中的一种。龟分枝杆菌最初定名为偶发—龟型复合物，直到1955年Gordon等对其详细描述后，才将龟分枝杆菌单独定为一个种，1972年将其分为3个亚种：龟分枝杆菌龟亚种（M. chelonae subs.chelonae,以前又称M.borstelense）、龟分枝杆菌脓肿亚种（M. chelonae subs.abscessus,以前又称M.abscessus,M.runyonii,M.piscium和M.fridmanii）和类龟分枝杆菌（M.chelinae-like organisms,又称M.Mucogenicum）［1］。
龟分枝杆菌是一种常见的环境腐物寄生菌，广泛分布于水和医院的灰尘中，故它是分枝杆菌医源性感染最常见的菌种之一。尽管文献报道有些龟分枝杆菌菌株对磺胺、红霉素等敏感［4］，但多数菌株对常见抗结核药物耐药。一旦感染，其临床上治疗比较困难，故应尽早明确诊断，控制医源性暴发流行。
一、涂片染色检查
自从1882年Koch发现结核分枝杆菌以来，涂片抗酸染色一直是临床上检查抗酸杆菌的首选方法，它包括直接涂片染色和浓缩集菌后涂片染色两种方法，染色方法以萋纳抗酸染色法为主［3］。尚有荧光染色法：金胺O染色法和吖啶橙染色法，由于荧光染色法采用高倍显微镜检查，阳性率高于抗酸染色，已被越来越多的实验室所接受［5］。当疑为分枝杆菌感染时（如久治难愈的伤口等），取伤口分泌物或痰液，首先应涂片染色检查分枝杆菌，同时进行分枝杆菌培养。
二、培养
尽管分枝杆菌培养基种类很多，但初代培养首选培养基为改良罗-琼(Lowenstein-Jensen)培养基，有条件的实验室可选用7H12B培养基(Becton dickinson公司)或变色液体培养基 (深圳市怡百世生物技术有限公司、MB-Redox biotest公司)，它们适用于临床上各种标本分离培养分枝杆菌，如痰、脓液、分泌物等。当伤口分泌物疑为RGM感染所致，综合性医院实验室可采用血液琼脂平板培养基或麦康凯(MacConkey)琼脂平板培养基(无氯化钠)分离培养［1，5，6］，尤其适用于除痰以外的其他标本。由于龟分枝杆菌广泛存在于环境中，常表现为一过性，从痰中较易分离出来，但并不表示龟分枝杆菌所致呼吸道感染，必须连续3次分离出同1菌株，依据非结核分枝杆菌病诊断标准，方可诊断为龟分枝杆菌感染。
三、生物学鉴定
1.龟分枝杆菌37℃于改良罗-琼培养基上培养2～7 d可见明显的菌落，菌落为无色、光滑、凸起。菌落涂片抗酸染色或荧光染色，证实为抗酸杆菌。再传代培养于噻吩-2-羧酸肼（TCH）培养基和对硝基苯甲酸（PNB）培养基上生长良好；传代于7H12B培养基内，24 h可见絮状生长；传代于变色液体培养基内，24 h培养基即可变紫色或变红，且有紫色菌体沉淀；能耐受5μg/ml α-硝基-α-乙酰氨基-β-羟基苯丙酮（NAP）。由此可确定为RGM。
2.当确定为RGM后，应进行芳香硫酸酯酶（3 d、14 d）试验、硝酸盐还原试验、铁吸收试验、麦康凯琼脂生长试验和30℃、37℃、45℃试验。除了龟分枝杆菌（类龟分枝杆菌除外）外，其他RGM硝酸盐还原试验和铁吸收试验均为阴性；除了耻垢分枝杆菌、耐热分枝杆菌和偶发分枝杆菌Ⅰ型外，其他RGM45℃均不能生长；除了耻垢分枝杆菌芳香硫酸酯酶（3 d）阴性外，其他RGM均为阳性；除了部分龟分枝杆菌龟亚种外，其他RGM均能在麦康凯琼脂培养基上生长。由此可以鉴定龟分枝杆菌。
3.待鉴定为龟分枝杆菌后，进行5%氯化钠耐受试验、2%苦味酸耐受试验、碳源（枸橼酸盐、甘露醇和肌醇等）底物利用试验，以鉴别龟分枝杆菌龟亚种、龟分枝杆菌脓肿亚种和类龟分枝杆菌［7］。在进行生物学鉴定时，对于菌龄、菌量、温度、气体等都应标准化。如龟分枝杆菌进行5%氯化钠耐受试验时，菌龄为对数生长期，菌量为1McFarland单位，温度为30℃，气体为空气等［6］。
此外，高压液相色谱分析分枝菌酸也可用作龟分枝杆菌鉴定的辅助指标［8］。
四、分子生物学鉴定
1.随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)：RAPD又称任意引物PCR。Williams最先使用的引物为9～10个bp，但RAPD技术现在采用的引物多为1条10～25个bp寡核苷酸序列，能在基因组DNA的长链中多处特异性的结合，因而产生相应数量的扩增片段。由于DNA序列上个别碱基的不同，如果发生在随机引物结合部位则改变扩增片段的数量，如果发生在引物结合部位之间，则改变某些扩增片段的长度，产生不同的DNA图谱。Linton等［9］在进行结核分枝杆菌DNA多态性分析时发现，引物长度为20个碱基最佳，他们同时筛选了40条引物，结果发现MTBC-RF、INS-2和IS986-FP引物能较好的用于结核分枝杆菌分型。Zhang等［10］筛选了10条引物用于龟分枝杆菌龟亚种、龟分枝杆菌脓肿亚种分型，结果表明OPA2、OPA18、INS-2和IS986-FP引物较好。Lai等［11］同样采用OPA2、OPA18、INS-2和IS986-FP引物鉴定龟分枝杆菌脓肿亚种所致的医源性感染也取得了满意的结果。我们的研究结果与此一致［12］，但是，为了获得较好的重复性，模板最好采用标准酚-氯仿抽提法或DNA提取试剂盒，模板存放时间不要太长，模板DNA浓度在0.3～1.0μg时，相应的引物浓度为1.6～6.4 μmol/L，镁离子浓度为2～2.5 mmol/L。
2.脉冲琼脂电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE):尽管PFGE已经代替质粒图谱（技术复杂）作为RGM DNA指印的主要方法，但约有50%的龟分枝杆菌脓肿亚种通过此法不能得到正确的结果［2，13］。Lai等［11］采用DraⅠ、XbaⅠ、AseⅠ和SpeⅠ消化龟分枝杆菌脓肿亚种染色体总DNA，进行PFGE，其结果不令人满意。Zhang等［10］采用DraⅠ、XbaⅠ或AsnⅠ消化龟分枝杆菌染色体总DNA，进行PFGE，结果9株龟分枝杆菌龟亚种PFGE图谱尚可，但118株龟分枝杆菌脓肿亚种只有46株结果令人满意。
3.PCR-限制性酶切图谱分析（PCR-restriction enzyme pattern analysis,PRA）：PRA是根据PCR扩增分枝杆菌属共有的分子量65 000热休克蛋白（heat shock protein,hsp-65）基因，产物经限制性内切酶消化，电泳后而形成的图谱分析，检测和鉴定分枝杆菌，用于诊断结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌感染。Wilson等［14］扩增hsp-65基因中439 bp片段，扩增片段经限制性内切酶BstEⅡ、HaeⅢ、MspⅠ、HinfⅠ、BsaHⅠ（必要时使用AciⅠ、HhaⅠ、NarⅠ）消化，293株需氧放线菌（其中170株分枝杆菌）中274株得到了正确鉴定。Steingrube等［15］扩增hsp-65基因中439 bp片段，扩增片段经限制性内切酶HaeⅢ和/或BstEⅡ消化，24株龟分枝杆菌脓肿亚种、16株龟分枝杆菌龟亚种和20株类龟分枝杆菌，正确鉴定率分别为96、94和100%。我们按照Steingrube等［15］报道的方法对7株导致医源性感染的龟分枝杆菌脓肿亚种进行鉴定，证实可能为同一菌株所致的医源性感染。此外，还有应用其它的靶基因序列进行PRA分析，如IS6110、16SrRNA、23 srRNA或16S-23SrRNA间隔序列。
五、药物敏感试验
龟分枝杆菌药物敏感试验方法有琼脂扩散法、绝对浓度法和Mueller-Hinton肉汤稀释法等［16-20］。治疗龟分枝杆菌感染主要依靠药敏试验选择药物及手术清创。龟分枝杆菌多对常见的抗结核药物耐药，一旦确定为龟分枝杆菌，则不必再做常规抗结核药物敏感试验［1］。Wallace等［16］研究表明：龟分枝杆菌龟亚种（59株）均对阿莫西林-克拉维酸、头孢西丁和头孢美唑耐药，61%的菌株对亚胺培南耐药；龟分支杆菌脓肿亚种（141株）对阿莫西林-克拉维酸、头孢西丁和头孢美唑耐药率分别为67%、13%和24%，亚胺培南耐药率为43%。克拉霉素是一种类似与阿齐霉素的大环内酯抗生素，已广泛用于治疗RGM感染。Villanueva等［2］单用克拉霉素治疗35例龟分枝杆菌脓肿亚种感染者，治愈率为23%；手术联合克拉霉素治疗148例龟分枝杆菌脓肿亚种感染者，治愈率达95%。尽管如此，在美国1990～1995年期间800例龟分枝杆菌感染者中，已有12例龟分枝杆菌脓肿亚种和6例龟分枝杆菌龟亚种感染复发者，克拉霉素MIC≥16μg/ml，其中已证实13例为23sRNA peptidyltransferase 点突变，即2058（38%）或2059（62%）位A变成了G或C［16］。关于克拉霉素、亚胺培南、环丙沙星、氧氟沙星、头孢西丁、妥布霉素和阿米卡星的MIC，不同的菌株差异较大［19，20］。
作者单位：熊礼宽(518020深圳市慢性病防治院肺部疾病研究所检验科)
杨应周(518020 深圳市慢性病防治院肺部疾病研究所检验科)
庄玉辉(解放军第三○九医院全军结核病研究中心)
参考文献
1，熊礼宽.龟分支杆菌龟亚种的分离与鉴定.临床检验杂志,1995,13:82-83.
