中华检验医学杂志2000年第23卷第4期

朱琳高海风

关键词；分枝杆菌；培养；菌型鉴定为了探讨分枝杆菌培养和菌型鉴定的方法，了解张掖地区分枝杆菌菌型分布情况，我们采集张掖地区1164份疑似肺结核患者痰液标本，进行分枝杆菌培养和菌型鉴定，现将结果报告如下。

一、材料和方法

1.标本来源：采集张掖地区六县(市)疑似肺结核患者未经化疗的痰液标本1164份。

2.标准菌株来源：省结核病防治所转赠的国家结核病控制中心参比实验室的标准菌株。

3.方法：按照《结核病诊断细菌学检验规程》(规程)操作^［1］。(1)分离培养基：丙酮酸钠培养基成分：磷酸二氢钾2.40 g、枸橼酸钠0.60 g、硫酸镁0.24 g、味精(纯度99%)7.20 g、蒸馏水600 ml、葡萄糖4.00 g、丙酮酸钠1.60 g、马铃薯粉30 g、全卵(鸡蛋)液1000 ml、2%孔雀绿溶液20 ml。制备方法：把盐类成分溶解后，10%NaOH调pH至7.2，再加入葡萄糖、马铃薯粉，放水浴锅内煮沸20 min。待冷，加入经搅拌用纱布过滤的全卵液1 000 ml、2%孔雀绿溶液20 ml，混匀分装，凝固灭菌。(2)标本的前处理方法及接种：取痰标本1～2 ml，加4% H₂SO₄溶液4～5倍量(依痰液稀粘度而定)，震荡30 min，促使充分液化，经4 000 r/min离心沉淀30 min，取沉渣物0.1 ml接种于丙酮酸钠培养基斜面上，每份标本接种2支试管，置37℃温箱内培养。每个步骤同时设标准菌种参比。(3)3种鉴别培养基：改良罗氏(Lewenstein-Jensen，L-J)培养基，制备同上述规程。噻吩-2-羟酸肼(2-Thiophene carboryLicacid by drazid，TCH)培养基：称取TCH 50 mg，加蒸馏水100 ml成为500 mg/ml浓度，取其1 ml加入小川培养基(同规程)100 ml中，使最终浓度为5μg/ml，混匀分装，凝固灭菌。对硝基苯甲酸(P-Nitropenziocacib，PNB)培养基：PNB用二甲亚枫溶解后加入小川培养基内，使其最终浓度为PNB0.5 mg/ml，混匀分装，凝固灭菌。(4)培养及菌型鉴定：将丙酮酸钠培养基斜面上37℃培养生长的菌落行Ziehl-Neelsen染色镜检、证实为抗酸菌的培养物制成10^-1 mg/ml菌液，分别接种于L-J、PNB、TCH斜面，并分别设标准菌株参比，37℃培养4周，L-J、TCH生长，PNB不生长者为人型结核菌；L-J生长、TCH、PNB不生长者为牛型结核菌；L-J、TCH和PNB均生长者，为非结核分枝杆菌。将初步筛选的菌株在标准菌种参比下根据生长特性和生化反应最后定型。(5)生化反应及生长特性：具备37℃生长，28℃及45℃均不生长、粗糙型菌落、产淡黄色素或无色，2～3周生长的共性，硝酸还原、尿素酶试验阳性、耐热触酶、吐温80水解试验阴性者为人型结核菌，上述4项生化反应均阴性者，为牛型结核菌；28℃、37℃全部生长，45℃大部分生长、菌落光滑或粗糙，3～21 d生长仅产色素，具有不同生化反应者为非结核分枝杆菌。

二、结果

1.涂片染色镜检(镜检)及培养结果：1 164份标本中，镜检、培养均阳性182份(15.6%)；仅镜检、培养阳性分别为33份(2.8%)，38份(3.2%)；阳性总数为253份(21.7%)。

2.菌型鉴定的认证：用标准菌株作参比，从标本前处理、接种、培养、菌型鉴定的各步骤与符合规程所列的标准菌株特征确定其准确无误；标本培养物的鉴别培养基、生长特性和生化反应与标准菌完全吻合者即认证定型。不相吻合者列入“未定型”。

3.菌型鉴定结果：220份培养阳性物，经Ziehl-Neelsen法染色验证为抗酸菌，标准菌种作参比、鉴别培养基初步筛选、生长特性和简便生化反应最后定型，人型结核菌198株，占90％，牛型结核菌11株，占5％，非结核分枝杆菌11株，占5％。11株非结核分枝杆菌，确定堪萨斯菌4株、胞内分枝菌1株、胃分枝菌2株，另有4株不具备标准菌种的分型特征，列入“未定型”。

三、讨论

1.寻求简便、快捷、实用的分枝杆菌鉴定的方法，是亟待解决的问题^［2，3］。用丙酮酸钠培养做基础培养基，L-J、PNB、TCH做分枝杆菌的初步筛选，并辅以简便生化反应，在标准菌参比下鉴定菌型，具有实用、简便的特点。

2.本次试验镜检阳性的33份标本，占总阳性数的13％(33/253),提示分枝杆菌检查时，如直接培养而不做镜检，会导致检出率降低；培养阳性的38份，占阳性总数的15%(38/253)，表明仅做镜检而不做培养，因部分标本含菌量较少不易涂片发现，也可使检出率降低。因此建议在检查分枝杆菌时，应同时对标本行镜检和培养，以提高检出质量。

作者单位：朱琳(734000甘肃省张掖地区卫生防疫站)

高海风(734000 甘肃省张掖地区卫生防疫站)

参考文献

1，中国防痨协会,结核病诊断细菌学检验规程.中国防痨杂志,1996,18:28.

2，陈东科，张秀珍.结核分枝杆菌四种检测方法的比较研究. 中华医学检验杂志,1996,19:229.

3，桂晓虹，孙泳棠,肖祥龙.鉴别人型及牛型结核分枝杆菌的方法比较. 中国防痨杂志,1996,18:125.