国外医学耳鼻咽喉科学分册2000年第24卷第1期

山东省肿瘤防治研究院头颈外科（济南 250117）房居高(综述)

山东医科大学附属医院耳鼻喉科栾信庸(审校)

摘要肿瘤转移是恶性肿瘤致死主要原因，肿瘤微转移灶是恶性肿瘤转移的早期事件，对微转移灶的早期检查有助于肿瘤的合理治疗，本文就目前肿瘤微转移灶的早期检查方法的某些进展作一简要综述

关键词：肿瘤微转移早期检查

肿瘤的浸润及转移是恶性肿瘤的重要特征，也是肿瘤患者死亡的主要原因^[1]，很多病人经手术治疗后临床未见有转移，但相当一部分病人术后仍有复发，这是因为目前临床的方法不能检查出治疗时业已存在的微转移。因此，对肿瘤的微转移的正确评估是肿瘤治疗的关键。如用常规检查法无转移的乳腺癌及大肠癌的患者约有25%最终死于复发和转移。近年来对肿瘤微转移的研究越来越受到重视，对常规病理不能检查出的微转移病灶，目前有以下几种方法进行检测。

【病理标本的连续切片法】病理标本的连续切片法是对病理标本进行连续切片，然后常规染色，光学显微镜下观察，而发现常规病理不能发现的病灶，可大大提高微转移的检出率。Yoshinaka^[2]对102例食管癌的纵隔淋巴结的连续切片发现有13.3%的淋巴结有微转移灶,有微转移的病人手术后生存率明显低于无转移者。Isozaki^[3]对胃癌的清扫淋巴结进行常规病理切片及连续切片的比较。发现常规切片的转移率是8.4%而连续切片的转移率是23.8%.对声门上喉癌的颈淋巴结转移的研究表明,常规病理切片的颈淋巴结的转移率为36%,而经连续切片检查发现有54%的颈淋巴结有转移灶,将淋巴结的转移率提高了21%,尤其对N₀淋巴结,常规切片的转移率为4.8%.而连续切片的转移率为33.3%^[4].病理标本连续切片的诊断率高,其缺点是对未形成转移灶的少量癌细胞不能识别,一个标本需切几十至上百张切片,工作量大,费时费力,有时容易漏检。

【免疫组织化学法】免疫组织化学法是利用抗原抗体反应的原理，来对组织内的细胞或其他组织成分进行定位的一种方法，定位后呈色反应，可鉴别单个的细胞，其诊断准确率及辨别率均低于常规组织切片染色。用细胞角蛋白单抗AE1/AE3对食管癌的纵隔淋巴结进行免疫组织化学染色，见31.7%的pN₀淋巴结有微转移灶,随访表明无微转移灶的pN₀患者的3年生存率为61%,有微转移灶的pN₀患者的3年生存率为41%.二者差异显著^[5],用细胞角蛋白单抗CK2对骨髓细胞进行APAAP法免疫组织化学染色,在大肠癌中，32%的根治性切除患者骨髓肿瘤细胞阳性,乳腺癌中20.6%阳性,,并且肿瘤细胞阳性者无瘤生存期明显短于阴性者^[6],并且乳腺癌患者骨髓中的微转移灶与原发灶的活检与否及时间无明显的相关性^[7]。有人认为免疫组织化学法辨认10⁵个骨髓细胞中的1个肿瘤细胞。但免疫组化需制备大量的抗体，染色复杂。

【转基因法】转基因法主要用于肿瘤转移的实验研究，其方法是将细菌的Lac z基因转入肿瘤细胞内，将肿瘤细胞接种后，对细胞或组织进行染色来辨别肿瘤细胞的方法，分辨率可达到单个细胞的水平，染色方法有X-Gal染色^[8]及5-镍-4氯-3吲哚-beta-D-吡喃半乳糖苷酶染色，使肿瘤细胞呈蓝黑色而易于辨认^[9]，可发现早期的小癌灶形成。也有用绿色荧光蛋白（green fluorescent protein ,GFP）基因转入肿瘤细胞内检查微转移灶的^[10]。这种方法可免去染色的麻烦，而直接在显微镜下观察新鲜组织就可确定肿瘤细胞及微转移灶的形成。转基因法要求技术条件高，只能用于动物模型，不适用于临床研究。

【原位杂交法】利用生物素标记的Alu探针,采用原位杂交,斑点分析技术(Southern blot)检测人基因中的所有的Alu序列从发现转移灶^[11]。这种方法在操作过程严禁人体细胞污染标本，否则将会产生假阳性的结果。这种方法也只能用于动物模型，不用于人体的临床检测。

【PCR】PCR技术是应用一对引物,在体外酶促合成特定的DNA片段,这个过程可反复进行20个周期以上,使原始靶DNA序列扩增10⁶-10⁸倍,也可用RT-PCR进行RNA的扩增。应用PCR检查外周血、骨髓、淋巴结中的肿瘤微转移灶有两种方法，一是检查肿瘤细胞中的因基因突变、染色体重排而产生的DNA异常；二是RT-PCR法扩增组织或肿瘤特异性的mRNA,它们在正常组织中不表达，其敏感性约为1×10^-6，比Southern blot敏感性提高约10 000倍，用细胞角蛋白CK19mRNA的RT-PCR检测乳腺癌病人腋窝淋巴结的微转移灶，对10个病理学阳性的淋巴结RT-PCR亦为阳性，而病理学阴性的53个淋巴结中有5个RT-PCR为阳性，表明有微转移灶^[12]。用癌胚抗原CEA mRNA的RT-PCR检测大肠癌的淋巴结，对30个病理为阳性的淋巴结RT-PCR亦为阳性，87个病理学为阴性的淋巴结RT-PCR检测中47个为阳性^[13]；另一组的该法检测腹部肿瘤患者的骨髓中，11例免疫组化为阴性的RT-PCR有4例为阳性^[14]。说明RT-PCR法较免疫组化法敏感。PCR法临床检测微转移灶要求测基因在待测肿瘤中突变率高，并且基因的碱基改变相对集中；用PCR法检测120例大肠癌的K-ras基因及P⁵³抑癌基因，检出71例有微转移灶，其中有一半以上于5年内复发，而阴性的无一例复发^[12，15]。

最近有用微卫星DNA的PCR法检测动物模型中的微转移灶，其原理是在人和动物基因组中存在一些由寡核苷本串联、重复排列而成的DNA序列，构成“数量可变的串联重复序列（VNTR）”。其中重复序列为1-6bp的重复顺序称为微卫星DNA（microsatelliteDNA）,如GACA，GATA，TCC等。这些微卫星DNA作为遗传标记，容易筛选并且顺序化，种类多，分部广泛，高度多态性，重组率低，在人群中表现高度的个体特异性，按照孟德尔共显方式遗传。微卫星DNA重复序列在一些遗传性疾病及肿瘤病中存在重复序列的不稳定性。自1993年Altone等^[16]在遗传性非息肉性结肠癌中发现微卫星DNA不稳定性（microsatellite instabillity,MSI）以来，人们又在许多肿瘤中发现了MSI，并且MSI在肿瘤细胞转移过程中不会发生变化^[17]。随机选取3个位点的微卫星DNA对人乳腺癌及裸鼠移植转移模型的检测表明，移植转移模型与人乳腺癌具有同源性，且这种方法检测微转移灶简单、敏感、特异性强^[18]。

综上所述，检测肿瘤微转移灶的方法多种多样，常规病理连续切片敏感性低，易有假阴性；PCR方法敏感性高，易有假阳性，应注意优化反应条件，减少误差。在实际应用中要具体分析应用。

参考文献

1 Chossein RA et al.Cancer,1996;78:10-14

2 Yoshinaka H et al.Nippon Geka Gakkai Zasshi,1992;93:1289-1296

3 Isozaki H et al.Hepatogastroenterology,1997;44:1133-1136

4 时曜唏等，中华耳鼻咽喉科发杂志，1990；25：234-236

5 Natsugoe S et al.Cancer,1998;83:858-866

6 陈道瑾，实用癌症杂志，1994；9：187-188

7 Singhal H et al.Ann Surg Oncol, 1997;4:503-505

8 Kobayashi K et al.Cancer Lett,1997;112:191-198

9 Lin WC et al.Cancer Res.1990;50:2808-2817

10 Chishima T et al.Cancer Res, 1997;57:2042-2047

11 Mckenzie BA et al.Cancer Commun,1991;3:15-19

12 野口ほか.癌の化学疗法,1996;23:50-52

13 Mori M et al. Cancer Res, 1995;55:3417-3420

14 Gerhard M et al. J Clin Oncol,1994;12:725-729

15 Hayashi N et al.Lancet,1995;345:1257-1259

16 Altonen LA et al.Science,1993;260(5109):812--816

17 Ishimaru G et al.lnt J Cancer(Pred Oncol),1995;64:153-157

18 李志洪等,中华医学遗传杂志,1998;15:354-356