国外医学临床生物化学与检验学分册1999年第第20卷第1期

卫生部成都生物制品研究所(610063)唐玉琴（综述）陈受霓（审校）

关键词：双特异单克隆抗体诊断

双特异抗体又称双功能抗体.此类抗体的两个抗原结合位点具有不同特异性,可同时结合两个不同的抗原或抗原决定簇,即结构上双价、功能上单价。它实际是一种杂交分子，两条H链之间与两条L链之间的结构不同，两个Fab片段也不同。早期的双特异抗体是用化学重组法制备，量少且活性较低。1983年，Milstein等在单克隆抗体的原理上，进一步运用杂交一杂交瘤技术，以生物学方法制备出双特异性单克隆抗体（简称BsMAb）

BsMAb既可通过融合两个杂交瘤形成来源于4个亲代细胞的四体瘤，也可用特异针对一种抗原的杂交瘤与用另一抗原免疫小鼠脾细胞融合而成三体瘤，这两种方法产生的杂交一杂交瘤分泌四条亲本肽链H₁，H₂，L₁，L₂。四条肽链可组成10种形式，分无活性、单特异性、双特异性3组，其抗原结合价有单价和双价。BsMAb为单价双特异抗体。

1 BsMAb的制备

1．1 三体瘤制备BsMAb由于杂交瘤细胞为HAT抗性（HAT^r），在融合前需将其回复突变至HAT敏感型（HAT^S）。此法常以碱基类似物诱导使旁路途径中关键酶失活，从而使细胞突变成HAT^S，如8-杂氮鸟嘌呤（8-AG）或6-巯基嘌呤可筛选出次黄嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型（HGPRT^-），5-溴2ˊ-脱氧尿嘧啶可筛选出胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK^-）。这样HAT^S杂交瘤与第二抗原免疫小鼠的脾细胞融合即为三体瘤，用HAT培养基以筛选杂交瘤同样的方法进行筛选。Tada等用此法从融合786孔中筛选出一株抗HRP/抗人淋巴毒素阳性克隆，用三种不同的方法检测均为双特异抗体阳性，产率接近总Ig的34%。

1．2 四体瘤制备BsMAb两个杂交瘤细胞株融合即为四体瘤.将一株杂交瘤保持HAT抗性,另一株杂交瘤则进行双重变异除回复筛选至HAT敏感外,再进一步诱导为药物抗性.用得较多的有乌苯苷^[6]、吐根碱、放线菌素D、新毒素等。譬如用一株HAT^S而乌苯苷抗性的杂交瘤与另一株HAT^r而乌苯苷抗性的杂瘤与另一株HAT^r而乌苯苷敏感的杂交瘤融合，产生的四体瘤将对HAT及乌苯苷均产生抗性。如果融合一天后，每孔加入含HAT及0.1mM乌苯苷的培养液,则只有四体瘤存活,生长有克隆的上清抗体活性超过90%,此时BsMAb的实际产量占总量Ig的12.5%~50%。这种事先选育好的双重变异亲代细功株可作为通用融合伙伴与任何另一株意欲进行试验的杂交瘤进行再杂交而获得四体瘤。另一种方法是融合两株单突变的杂交瘤，两株都对HAT敏感，一株为HGPRT^{?/SUP＞，另一株为TK?/SUP＞，以HAT培养基筛选出四体瘤。}

^{随着分子生物学的发展，人们应用基因工程技术将抗neo基因转移到HGPPT?/SUP＞杂交瘤中，使抗neo基因整合到染色休上，可使细胞对G418（氨基甙类抗生素）产生抗性，而未导入抗neo基因的杂交瘤对G481敏感，故可用HAT及G418双重选择培养来筛选四体瘤，使诱导时间明显缩短。DeLau等更进一步用逆转录病毒作载体转导，以获得高效率的基因转移。}

^{Koolwijk等用异硫氰酸荧光素（FITC）和四甲基异硫酸罗丹明（TRITC）分别标记亲代杂效瘤细胞，融合后用荧光激活细胞分类仪（FACS）来分选出双标记细胞，这种双标记细胞即为四体瘤细胞。本法可省去前述建述变异株的种种麻烦。四体瘤的两种亲代杂交瘤细胞，其特性均已事先知道，并可优选。这样融合后的克隆选择能更多地符合愿望。}

1．3 双特异抗体的纯化 karawajew等直接将腹水稀释后过羟基磷灰石柱，得到的第二峰即为BsMAb。更常用的是腹水经50%饱和硫酸铵盐析后，再用阴离子交换层析纯化BsMAb，Palazzo等将粗制抗体过亲和层析柱（抗鼠IgG亲和柱），此时抗体含两种亲本抗体及BsMAb，进一步用阳离子交换层析分离纯化，中间峰为BsMAb。Tada等用双亲和层析结合HPLC羟基磷灰石分离纯化BsMAb，粗制抗体过Protein a-sepharose柱，再过HRP偶联的Cellulofin柱，以除去亲代非抗HRP抗体，将抗HRP活性的抗体再过羟基磷灰石HPLC柱，第4峰为BsMAb。

由于杂交棗杂交瘤分泌的抗体有前述10种分子，故分离纯化相当困难，因上必须根据实际需要来选择适当的方法。

2双特异抗体在免设诊断学上的应用

BsMAb使免疫学方法的实际应用较单克隆抗体更为优异。现以酶免疫学为例介绍一些双特异单克隆抗体的作用。

2．1 肿瘤诊断

2．1．1 甲胎蛋白（AFP）在肝细胞性肝癌及卵黄囊瘤病人的血清中明显增高，测定AFP含量有助于肝癌等癌症的诊断。Karawajew等将制备的抗HRP/抗AFP双特异抗体用双位点结合ELISA测定血清中AFP。以单克隆抗体作固相抗体，双特异抗体作液相抗体，两者表位不同。抗AFP单克隆抗体包板封闭后，依次分步加入含有AFP的标准血清，BsMAb、HRP、底物，492nm测定OD值，检出AFP的极限为5ng/ml。病理情况下，血清AFP水平高于25ng/ml，因此这个灵敏度足以用于临床免疫试验。

2．1．2胚抗原（CEA）在消化道肿瘤及一些消化道外肿瘤时，癌细胞将其分泌入体液和血液循环，使其异常增高。Gyorgy等制备出抗CEA/抗β-半乳糖苷酶(enaymeβ杇alactosidase GZ)双特异抗体，并建立均相酶免疫试验，定量测定CEA。均相酶免疫试验的特点是免疫反应及酶反应同时进行。CEA具有两个不同的、无竞争性的表位，可分别建立抗CEA-₁/抗GZ和抗CEA_-2/抗GZ两种杂交抗体。在诸反应物浓度比例合适的情况下，混合后酶、CEA和BsMAb（此时有两个杂交抗体）之间即可形成环状复合物，增强了彼此结合能力。再者酶与抗体结合在一定程度上防止了酶的热变性，而环状复合物较之没有CEA的GZ-抗体复合物稳定性好，酶分子最终在量上的增加有助于试验，较固相酶免疫反应更敏感。实验得出，CEA浓度为0~75 ng/ml时酶活性最高；CEA浓度大于75ng/ml时则出现前带效应。这是由于CEA浓度过大，根据化学平衡原理，环状复合会展开成线状复合物。实际上CEA浓度几乎都小于100ng/ml，而健康人则小于5ng/ml，所以CEA高浓度时的前带效应并不限制其实际应用。

2．2 细胞因子的测定

2．2．1 干扰素的测定 kontsekova等制备出抗HRP/抗IFN_α2BsMAb，用一步夹心酶免疫试验检测IFN_α2。此法在2~3h之内即可完成，而生物学方法检测需3天以上。此法能检出IFN_α20.1ng/ml.相当于生物学方法的10U/ml，其灵敏度也与用HRP标记IFN的ELISA几乎一致，且避免了为获得标记抗体而进行化学结合的种种弊端，不失敏感性，更具可重复性。

2．2．2人淋巴毒素的测定 Tada等制备出抗人淋巴毒素(hLT)/抗HRP BsMAb，用竞争和夹心法系统建立了一步法酶免疫试验。方法简单，能测定hLT1-100U/ml，与用L₉₂₉细胞溶解法生物学试验测得的hLT具有很好的相关性(r=0.96)。一步夹心法ELISA以及溶解L₉₂₉细胞生物学试验的敏感性相同，最小可检出1U/ml或0.1~0.2mg/ml。检出时间一步法为2h，两步法为3~4h，生物学检测为3天以上。用BsMAb检测，非特异吸附低于HRP标记的抗hLT，从而大大提高了灵敏感。

2．3免疫组化中的抗原定位 Milstein等制备了抗HRP/抗生长激素释放抑制因子和抗HRP/抗P物质BsMAb，用它们来进行组织细胞上的抗原定位，采用一步免疫细胞化学试验（ICC），无论在光镜还是在电镜水平上，敏感性、信噪化、染色操作的简化、保护亚细胞成分的超微结构等方面都有重大改善。用BsMAbm进行试验，免疫反应可以均匀地扩散到厚度50μm的整个切片层，这是常规方法所不及的。

2．4 免疫度验通用试剂 kenigsberg等制备了抗HRP/抗兔IgG BsMAb，识别IgG分子的B₄Kap-pa轻链，对其他3个同种异型轻链民有交叉反应，不与重链结合。可用作两步法细胞免疫化学试验中的通用扩展试剂，用兔免疫力血清作为第一抗体，用于检测或定位降钙素基因相关肽（CRP）及神经胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）。用兔抗CGRP作第一抗体，BsMAb作第二抗体进行两步法ICC。在大鼠脊髓三叉神经核表层纤维及大鼠下唇皮肤均可发现有CGRP免疫活性存在。免疫染色的质量远优于常规PAP法，由于无背景染色，在切片上可清晰地分辩出单个免疫活性纤维以及它们的曲张。用同样的方法在大鼠胚脑中隔细胞的原代培养中，可在星形神经胶质细胞中观察到GFAP，而较小的类神经元细胞中则无，背景依然清晰。

用抗HRP/抗兔IgG作竞争性ELISA检测CGRP，灵敏度为190pg/孔或50fmol/孔，这种BsMAb试剂可在定量免疫学试验中用于检测生物材料中的有关肽类。

Karawajew将抗FITC/抗HRP bsMAb用作免疫试验的通用结合试剂。用双位点结合的ELISA检测AFP和HCG，单克隆抗体（第一抗体）结合于固相，FITC标记的单克隆抗体的（第二抗体，识别抗）抗作用于液相，它们识别待测抗原的不同位点，标志酶为HRP，BsMAb在FITC标高单克隆抗体及HRP之间起桥联作用。检测ARP的极限为5ng/ml，检测HCG的极限为5U/ml。灵敏度与其他方法一致。此系统可用于检测不同抗原，在ELISA试验中为指示系统广泛应用。

2．5 在病毒诊断上的应用刘英等制<